Istituzione di un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente con tessuti di osteosarcoma umano

Riepilogo

Il presente protocollo descrive il metodo per stabilire un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente (PDX) utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.

Abstract

L'osteosarcoma è il tumore osseo maligno primario più comune nei bambini e negli adolescenti. Nonostante lo sviluppo di nuovi piani di trattamento negli ultimi anni, la prognosi per i pazienti con osteosarcoma non è migliorata in modo significativo. Pertanto, è fondamentale stabilire un modello preclinico robusto con un'elevata fedeltà. Il modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) preserva fedelmente le caratteristiche genetiche, epigenetiche ed eterogenee delle neoplasie maligne umane per ciascun paziente. Di conseguenza, i modelli PDX sono considerati autentici modelli in vivo per lo studio di vari tumori negli studi di trasformazione. Questo articolo presenta un protocollo completo per la creazione e il mantenimento di un modello murino PDX che rispecchia accuratamente le caratteristiche morfologiche dell'osteosarcoma umano. Ciò comporta il trapianto immediato di tessuto di osteosarcoma umano appena resecato in topi immunocompromessi, seguito da un successivo passaggio. Il modello descritto funge da piattaforma per studiare la crescita, la resistenza ai farmaci, la recidiva e le metastasi dell'osteosarcoma. Inoltre, aiuta a selezionare le terapie target e a stabilire schemi di trattamento personalizzati.

Introduzione

L'osteosarcoma è un tumore maligno osseo primario derivato dalle cellule del lobo interosseo ed è più comune negli adolescenti e nei bambini. Si verifica spesso nell'epifisi della diafisi lunga ed è caratterizzata da elevata malignità, metastasi precoci e prognosi infausta ^1,2. Le metastasi polmonari sono la principale causa di morte nei pazienti con osteosarcoma. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti con osteosarcoma non metastatico è del 65%-70%³. Tuttavia, negli ultimi 40 anni, il tasso di sopravvivenza a 5 anni (solo il 20%) dei pazienti con osteosarcoma metastatico non è migliorato in modo significativo e il 25% dei pazienti con osteosarcoma presenta metastasi al momento della diagnosi⁴. Attualmente, i farmaci di prima linea per il trattamento dell'osteosarcoma hanno raggiunto un consenso, ma ci sono ancora differenze significative nel regime chemioterapico e nel tempo di trattamento⁵. È importante eseguire esperimenti preclinici basati su modelli animali appropriati per ottenere regimi chemioterapici più efficaci.

Attualmente, i modelli comunemente utilizzati per gli esperimenti preclinici sull'osteosarcoma includono colture cellulari in vitro basate su linee cellulari e xenotrapianti derivati da cellule in vivo (CDX), nonché xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)^6,7.

Le linee cellulari sono utili per la coltura e per l'uso in studi in vitro , o per il trapianto in topi immunodeficienti per stabilire modelli CDX⁸. Tuttavia, le linee cellulari coltivate in vitro potrebbero non riflettere accuratamente l'eterogeneità dei tumori maligni e le caratteristiche individuali dei pazienti a causa di potenziali mutazioni che si verificano per adattarsi all'ambiente di coltura in vitro durante passaggi ripetuti. Inoltre, mancano del microambiente e del sistema immunitario necessari per la crescita e lo sviluppo del tumore in vivo. Sebbene i modelli CDX offrano alcuni vantaggi rispetto alla coltura cellulare in vitro , potrebbero ancora non riflettere pienamente le caratteristiche individuali dei pazienti con osteosarcoma, sebbene i tessuti tumorali ottenuti dai modelli CDX abbiano una limitata eterogeneità intratumorale e rappresentazione del sistema immunitario rispetto alle linee cellulari coltivate in vitro⁹. Pertanto, è fondamentale stabilire un modello preclinico ad alta fedeltà.

I modelli PDX prevedono il trapianto immediato di tessuti tumorali umani appena resecati in topi immunodeficienti. Questo metodo consente di preservare fedelmente le caratteristiche genetiche, epigenetiche ed eterogenee delle neoplasie maligne umane per ciascun paziente, anche dopo passaggi successivi nei topi. Inoltre, i modelli PDX sono noti per prevedere con precisione gli esiti clinici successivi¹⁰, rendendoli strumenti preziosi per la creazione di trattamenti personalizzati e l'avanzamento della ricerca sulla medicina di precisione¹¹.

Questo lavoro descrive la procedura per stabilire un modello di PDX in topi immunodeficienti mediante trapianto di tessuto di osteosarcoma umano. Tali modelli fungono da piattaforme per condurre esperimenti preclinici per l'osteosarcoma.

Protocollo

Tutti gli studi che coinvolgono tessuti umani sono stati approvati dal Comitato di revisione etica istituzionale dell'ospedale Longhua, affiliato all'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (Shanghai, Cina) (2013LC52), e il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Il numero IACUC per questo studio sugli animali è PZSHUTCM221017013. Ai topi maschi di quattro settimane di CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl è stata fornita una dieta per roditori irradiata a doppio leone GB 14924.3 e acqua sterile, e sono stati alloggiati in una gabbia per topi IVC con cinque topi per gabbia, in condizioni SPF con un ciclo luce/buio di 12 ore. La Tabella dei Materiali include informazioni dettagliate su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione del tessuto dell'osteosarcoma umano

NOTA: In questo studio, il tessuto dell'osteosarcoma umano è stato resecato¹² dalla lesione del femore di un paziente di 15 anni con osteosarcoma prima della chemioterapia.

1. Conservare immediatamente il tessuto dell'osteosarcoma appena resecato in una soluzione protettiva dei tessuti per massimizzare la conservazione dell'attivazione delle cellule dell'osteosarcoma dopo il risciacquo con soluzione fisiologica sterile.
   NOTA: I tessuti dell'osteosarcoma appena resecati devono essere trapiantati nei topi il prima possibile. Possono essere conservati nella soluzione protettiva dei tessuti per un massimo di 24 ore prima del trapianto. I tessuti dell'osteosarcoma utilizzati per la modellazione devono provenire da pazienti che non sono stati sottoposti a chemioterapia. L'attività delle cellule tumorali dei pazienti che hanno ricevuto la chemioterapia sarà scarsa, portando al fallimento della creazione del modello e alla perdita di alta fedeltà.
2. Trasferire il prima possibile i tessuti dell'osteosarcoma appena resecati conservati nella soluzione protettiva tissutale.
3. Predisporre strumenti e materiali sperimentali per la messa a punto del modello PDX: bisturi (Figura 1A); pinzette oftalmiche (Figura 1B, C); forbice oftalmica (Figura 1D); ago da sutura (Figura 1E); linea di sutura (Figura 1F); porta aghi diritto (Figura 1G); pennarello (Figura 1H).
   NOTA: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterilizzati in autoclave prima dell'uso.
4. Sciacquare due volte i tessuti dell'osteosarcoma con soluzione fisiologica sterile pre-raffreddata in una cappa sterile.
5. Rimuovere le aree del tessuto dell'osteosarcoma con sanguinamento e necrosi.
6. Tagliare il tessuto pulito dell'osteosarcoma in³ pezzi di 3 mm con un bisturi in una piastra di coltura contenente soluzione fisiologica sterile pre-raffreddata e tenerlo in ghiaccio.

2. Costituzione di modelli PDX mediante trapianto di tessuto di osteosarcoma nella regione del fianco del topo

1. Somministrare l'analgesia preoperatoria di meloxicam (5 mg/kg/24 h) mediante iniezione sottocutanea nei topi e posizionare i topi nudi su teli chirurgici sterili. Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
2. Indurre l'anestesia nei topi esponendoli al 3% di isoflurano e al 97% di ossigeno. Dopo che i topi sono stati completamente anestetizzati, trasferirli sul cono del naso e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,5% e ossigeno al 98,5%.
3. Pizzica le dita dei piedi per assicurarti che i topi siano completamente anestetizzati e attendi più a lungo se ci sono ancora spasmi o reazioni convulsive.
   NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando apparecchiature sterili in una cappa sterile. Evita la secchezza dei topi durante l'anestesia applicando un unguento oftalmico sui loro occhi.
4. Fissare il mouse in posizione di decubito laterale (Figura 2A). Disinfettare un lato della regione del fianco del topo per il trapianto di tessuto di osteosarcoma 3 volte con cicli alternati di iodio povidone e batuffoli di cotone disinfettante all'etanolo al 70%.
   NOTA: La disinfezione chirurgica viene eseguita in uno schema circolare, iniziando dal centro e procedendo a spirale verso l'esterno.
5. Segnare il sito dell'incisione chirurgica sulla pelle con un pennarello.
6. Praticare un'incisione di 5 mm dalla pelle ai tessuti sottocutanei con un bisturi (Figura 2B).
7. Sollevare la pelle laterale superiore del margine dell'incisione con una pinzetta oftalmica usando la mano sinistra ed eseguire la dissezione smussata verso l'alto sotto il derma dei topi con un portaago dritto usando la mano destra (Figura 2C).
8. Tenere la pelle laterale superiore dell'incisione con le pinzette oftalmiche usando la mano sinistra e posizionare il tessuto dell'osteosarcoma sotto la pelle a circa 5 mm sopra il margine dell'incisione con una pinzetta oftalmica usando la mano destra per trapiantare il tessuto dell'osteosarcoma (Figura 2C).
   NOTA: Assicurarsi che il tessuto dell'osteosarcoma sia trapiantato appena sotto il derma della pelle. La dissezione smussata viene eseguita con una pinza di dissezione diritta e smussata, come un portaago dritto, per evitare di penetrare nella cavità toracica del topo mentre si trova lo strato dermico della pelle del topo.
9. Sutura l'incisione utilizzando una sutura riassorbibile con 2-3 punti di sutura per un'incisione di 5 mm (Figura 2D).
10. Rimetti i topi in gabbie pulite e monitorali fino a quando non si riprendono completamente dall'anestesia.
    NOTA: La PDX stabilita dal trapianto del tessuto dell'osteosarcoma umano è designata come passaggio 0 (P0), la PDX stabilita dal trapianto del tessuto PDX a P0 è designata come passaggio 1 (P1), seguita da P2 e P3.

3. Raccolta di tessuti tumorali PDX

1. Misurare il volume del tumore una volta alla settimana. Quando la dimensione del tumore raggiunge i 1500 mm³, sopprimere i topi utilizzando il metodo della lussazione cervicale dopo l'inalazione di CO₂ . Gli endpoint umanitari includono ulcerazioni tumorali o problemi con la mobilità degli arti anteriori.
   NOTA: Misurare il diametro lungo (a) e il diametro corto (b) del tumore utilizzando un calibro. Calcolare il volume tumorale (V) utilizzando la formula: V = 1/2 × a × b².
2. Posizionare il mouse lateralmente per esporre il tumore e disinfettare la pelle nel sito del tumore con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol.
3. Usa le forbici oftalmiche per separare l'intero tumore. Pesare la massa tumorale utilizzando una bilancia elettronica.

4. Esame patologico dei tessuti tumorali clinici primari e PDX

1. Fissare i tessuti tumorali¹³ in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore. Sciacquare accuratamente i tessuti tumorali con acqua corrente per rimuovere il fissativo.
2. Disidratare e incorporare i tessuti tumorali nella paraffina¹⁴.
3. Affettare i tessuti tumorali ed eseguire l'esame istologico di routine¹⁵.

Risultati

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per stabilire un modello murino di PDX, preservando le caratteristiche morfologiche dell'osteosarcoma umano dopo il trapianto immediato di tessuto di osteosarcoma umano appena resecato e passaggi successivi nei topi. Qui, un modello murino PDX è stato stabilito con successo utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.

La Figura 3A mostra un topo rappresentativo di PDX a P0, due me...

Discussione

I modelli PDX possono simulare le caratteristiche dei tumori umani e mantenere una maggiore somiglianza con il tumore primario, comprese le alterazioni genetiche e genomiche, l'istologia, l'eterogeneità e il profilo di espressione genica 16,17,18,19. Pertanto, preservano i fenotipi molecolari e i genotipi dei pazienti oncologici, fornendo approcci innovativi p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution