人骨肉瘤组织患者来源的异种移植小鼠模型的建立

摘要

本方案描述了使用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植物 （PDX） 小鼠模型的方法。

摘要

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。尽管近年来制定了新的治疗计划，但骨肉瘤患者的预后并未显著改善。因此，建立一个具有高保真度的稳健临床前模型至关重要。患者来源的异种移植物 （PDX） 模型忠实地保留了每位患者人类恶性肿瘤的遗传、表观遗传和异质性特征。因此，PDX 模型被认为是在转化研究中研究各种癌症的真实 体内 模型。本文提出了一种用于创建和维护 PDX 小鼠模型的综合方案，该模型准确反映了人骨肉瘤的形态学特征。这包括立即将新鲜切除的人骨肉瘤组织移植到免疫功能低下的小鼠中，然后连续传代。所描述的模型用作研究骨肉瘤的生长、耐药、复发和转移的平台。此外，它还有助于筛选目标疗法和建立个性化治疗方案。

引言

骨肉瘤是一种源自骨间叶细胞的原发性骨恶性肿瘤，最常见于青少年和儿童。它通常发生在长骨干的骨骺中，以高度恶性、早期转移和不良 预测 ^1,2 为特征。肺转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。非转移性骨肉瘤患者的 5 年生存率为 65%-70%³。然而，在过去的 40 年中，转移性骨肉瘤患者的 5 年生存率 （仅 20%） 没有显着提高，25% 的骨肉瘤患者在诊断时有转移⁴。目前，骨肉瘤治疗的一线药物已达成共识，但化疗方案和治疗时间仍存在显著差异⁵。重要的是根据适当的动物模型进行临床前实验以获得更有效的化疗方案。

目前，通常用于骨肉瘤临床前实验的模型包括基于细胞系的体外细胞培养和体内细胞来源的异种移植物 （CDX），以及患者来源的异种移植物 （PDX）^6,7。

这些细胞系便于培养和体外研究，或移植到免疫缺陷小鼠中以建立 CDX 模型⁸。然而，体外培养的细胞系可能无法准确反映恶性肿瘤的异质性和患者的个体特征，因为在重复传代过程中为适应体外培养环境而发生的潜在突变。此外，它们缺乏体内肿瘤生长和发育所需的微环境和免疫系统。虽然 CDX 模型与体外细胞培养相比具有一些优势，但它们仍然可能无法完全反映骨肉瘤患者的个体特征，尽管与体外培养的细胞系相比，从 CDX 模型获得的肿瘤组织具有有限的瘤内异质性和免疫系统代表性 ⁹。因此，建立具有高保真度的临床前模型至关重要。

PDX 模型涉及将新鲜切除的人类癌组织立即移植到免疫缺陷小鼠中。这种方法允许忠实地保留每位患者人类恶性肿瘤的遗传、表观遗传和异质性特征，即使在小鼠连续传代之后也是如此。此外，众所周知，PDX 模型可以准确预测以后的临床结果¹⁰，使其成为创建个体化治疗和推进精准医学研究的宝贵工具¹¹。

这项工作描述了通过移植人骨肉瘤组织在免疫缺陷小鼠中建立 PDX 模型的程序。此类模型可作为进行骨肉瘤临床前实验的平台。

研究方案

所有涉及人体组织的研究均已获得上海中医药大学（中国上海）附属龙华医院机构伦理审查委员会 （2013LC52） 的批准，并根据赫尔辛基宣言获得了患者的书面知情同意书。该动物研究的 IACUC 编号为 PZSHUTCM221017013。向 4 周龄雄性 CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl 小鼠提供双狮子辐照啮齿动物饮食 GB 14924.3 和无菌水，并饲养在 IVCs 小鼠笼中，每个笼子 5 只小鼠，在 SPF 条件下，光照/黑暗循环 12 小时。 材料表 包括有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息。

1. 人骨肉瘤组织的制备

注意：在这项研究中，在化疗前从一名 15 岁骨肉瘤患者的股骨病变中切除了¹² 人骨肉瘤组织。

1. 立即将新鲜切除的骨肉瘤组织储存在组织保护溶液中，以最大限度地保留用无菌生理盐水冲洗后的骨肉瘤细胞活化。
   注意：新鲜切除的骨肉瘤组织必须尽快移植到小鼠体内。移植前，它们可以在组织保护溶液中储存最多 24 小时。用于建模的骨肉瘤组织必须来自未接受化疗的患者。接受化疗的患者的肿瘤细胞活性会很差，导致模型建立失败和高保真度丧失。
2. 将储存在组织保护液中的新鲜切除的骨肉瘤组织尽快转移到实验室。
3. 准备用于建立 PDX 模型的实验仪器和材料：手术刀（图 1A）;眼镊（图 1B，C）;眼科剪刀（图 1D）;缝合针（图 1E）;缝合线（图 1F）;直针架（图 1G）;记号笔（图 1H）。
   注意：确保在使用前通过高压灭菌对所有手术器械进行消毒。
4. 在无菌罩中用预冷的无菌生理盐水冲洗骨肉瘤组织两次。
5. 切除出血和坏死的骨肉瘤组织区域。
6. 在含有预冷无菌生理盐水的培养皿中，用手术刀将清洁的骨肉瘤组织切成 3 毫米³ 块，并保持在冰上。

2. 小鼠侧腹骨肉瘤组织移植建立 PDX 模型

1. 通过皮下注射小鼠给予美洛昔康 （5 mg/kg/24 h） 的术前镇痛，并将裸鼠放在无菌手术单上。在整个手术过程中提供热支持。
2. 通过将小鼠暴露于 3% 异氟醚和 97% 氧气来诱导小鼠的麻醉。小鼠完全麻醉后，将其转移到鼻锥中，并用 1.5% 异氟醚和 98.5% 氧气维持麻醉。
3. 捏住脚趾以确保小鼠完全麻醉，如果仍然有痉挛或抽搐反应，请等待更长的时间。
   注意：所有程序都必须在无菌罩中使用无菌设备进行。通过在小鼠的眼睛上涂抹眼药膏来避免小鼠在麻醉期间干燥。
4. 将鼠标固定在侧卧位（图 2A）。用聚维酮碘和 70% 乙醇消毒棉球交替轮次消毒小鼠骨肉瘤组织移植的小鼠侧腹区域的一侧 3 次。
   注意：手术消毒以圆形模式进行，从中心开始向外螺旋。
5. 用记号笔在皮肤上标记手术切口部位。
6. 用手术刀从皮肤到皮下组织做一个 5 毫米的切口（图 2B）。
7. 用左手用眼镊提起切口边缘的上侧皮肤，用右手用直针架在小鼠的真皮下向上进行钝性解剖（图 2C）。
8. 用左手用眼镊握住切口的上侧皮肤，用右手用眼镊将骨肉瘤组织放在切口边缘上方约 5 毫米的皮肤下，以移植骨肉瘤组织（图 2C）。
   注意：确保骨肉瘤组织移植到皮肤真皮正下方。使用直而钝的解剖钳（例如直针架）进行钝性解剖，以避免在找到小鼠皮肤的真皮层时穿透小鼠胸腔。
9. 使用可吸收缝合线缝合切口，缝合 2-3 针，切口为 5 毫米（图 2D）。
10. 将小鼠放回清洁笼子并监测它们，直到它们从麻醉中完全恢复。
    注：通过移植人骨肉瘤组织建立的 PDX 指定为第 0 代 （P0），通过在 P0 移植 PDX 组织建立的 PDX 称为第 1 代 （P1），然后是 P2 和 P3。

3. PDX 肿瘤组织的收集

1. 每周测量一次肿瘤体积。当肿瘤大小达到 1500 mm³ 时，吸入 CO₂ 后使用宫颈脱位法对小鼠实施安乐死。人道终点包括肿瘤溃疡或前肢活动问题。
   注意：使用卡尺测量肿瘤的长直径 （a） 和短直径 （b）。使用以下公式计算肿瘤体积 （V）：V = 1/2 × a × b²。
2. 将鼠标横向放置以暴露肿瘤，并用浸有酒精的棉球对肿瘤部位的皮肤进行消毒。
3. 使用眼用剪刀分离整个肿瘤。使用电子秤称量肿瘤质量。

4. 原发性临床和 PDX 肿瘤组织的病理检查

1. 将肿瘤组织¹³ 固定在含有 30 mL 10% 中性缓冲福尔马林溶液的 50 mL 管中 24 小时。用流水彻底冲洗肿瘤组织以去除固定剂。
2. 将肿瘤组织脱水并包埋在石蜡¹⁴ 中。
3. 切片肿瘤组织并进行常规组织学检查¹⁵.

结果

该方案描述了建立 PDX 小鼠模型的详细程序，在立即移植新鲜切除的人骨肉瘤组织和小鼠连续传代后保留人骨肉瘤的形态学特征。在这里，使用人骨肉瘤组织成功建立了 PDX 小鼠模型。

图 3A 显示了 PDX 在 P0 的代表性小鼠，在一名 15 岁患者移植股骨肉瘤组织两个月后。 图 3B 描绘了 P1 处 PDX 的代表性小鼠，?...

讨论

PDX 模型可以模拟人类癌症的特征，并保留与原发肿瘤的更多相似性，包括遗传和基因组改变、组织学、异质性和基因表达谱 16,17,18,19。因此，它们保留了癌症患者的分子表型和基因型，为研究生物学和评估潜在治疗方法提供了创新方法。这些方法包括对与真实临床反应反应?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution