著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本プロトコールは、ヒト骨肉腫組織を用いて患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルを確立する方法を記載している。

要約

骨肉腫は、小児および青年期に最もよくみられる原発性悪性骨腫瘍です。近年、新たな治療計画が策定されているにもかかわらず、骨肉腫患者の予後は大きく改善していません。したがって、忠実度の高い堅牢な前臨床モデルを確立することが重要です。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存します。その結果、PDXモデルは、形質転換研究におけるさまざまながんを研究するための本物の in vivo モデルと見なされています。この記事では、ヒト骨肉腫の形態学的特徴を正確に反映したPDXマウスモデルを作成および維持するための包括的なプロトコルを紹介します。これには、新たに切除されたヒト骨肉腫組織を免疫不全マウスに直ちに移植し、その後、連続的に継代することが含まれます。記載されているモデルは、骨肉腫の成長、薬剤耐性、再発、および転移を研究するためのプラットフォームとして機能します。さらに、標的治療薬のスクリーニングと個別化治療スキームの確立を支援します。

概要

骨肉腫は、骨間葉細胞に由来する原発性骨悪性腫瘍であり、青年および小児に最も多くみられます。これはしばしば長骨幹の骨端に発生し、悪性度が高く、早期転移、予後不良を特徴としています1,2。肺転移は、骨肉腫患者の主な死因です。非転移性骨肉腫患者の5年生存率は65%-70%3です。しかし、過去40年間で、転移性骨肉腫患者の5年生存率(わずか20%)は有意に改善しておらず、骨肉腫患者の25%が診断時に転移を持っています4。現在、骨肉腫治療の第一選択薬はコンセンサスに達していますが、化学療法のレジメンと治療時間には依然として大きな違いがあります5。より効果的な化学療法レジメンを得るためには、適切な動物モデルに基づく前臨床試験を行うことが重要です。

現在、骨肉腫の前臨床実験に一般的に使用されるモデルには、細胞株ベースのin vitro細胞培養およびin vivo細胞由来異種移植片(CDX)、および患者由来異種移植片(PDX)6,7が含まれます。

これらの細胞株は、培養やin vitro研究での使用、または免疫不全マウスへの移植によるCDXモデル8の確立に便利です。しかし、in vitroで培養した細胞株は、継代を繰り返す間にin vitro培養環境に適応するために生じる可能性のある突然変異により、悪性腫瘍の不均一性や患者の個々の特性を正確に反映できない場合があります。さらに、in vivoでの腫瘍の成長と発生に必要な微小環境と免疫系を欠いています。CDXモデルはin vitro細胞培養に比べていくつかの利点がありますが、CDXモデルから得られた腫瘍組織は、in vitroで培養された細胞株と比較して腫瘍内の不均一性および免疫系の表現が限られているにもかかわらず、骨肉腫患者の個々の特性を完全に反映していない可能性があります9。そのため、忠実度の高い前臨床モデルを確立することが重要です。

PDXモデルでは、切除したばかりのヒトがん組織を免疫不全マウスに直ちに移植します。この方法により、マウスで連続的に経過した後でも、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存することができます。さらに、PDXモデルは、その後の臨床転帰10を正確に予測することが知られており、個別化された治療法を作成し、精密医療研究を前進させるための貴重なツールとなっています11。

この研究では、ヒト骨肉腫組織を移植することにより、免疫不全マウスにPDXモデルを確立する手順について説明します。このようなモデルは、骨肉腫の前臨床実験を実施するためのプラットフォームとして機能します。

プロトコル

ヒト組織を対象としたすべての研究は、上海中医薬大学(中国・上海)傘下の龍華病院の制度倫理審査委員会によって承認されており(2013LC52)、ヘルシンキ宣言に基づき、患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。この動物実験のIACUC番号はPZSHUTCM221017013です。4週齢の雄 CAnN.Cg-Foxn1nu/Cllマウスに、ダブルライオン照射げっ歯類食GB 14924.3と滅菌水を与え、12時間の明暗サイクルのSPF条件下で、ケージあたり5匹のマウスをIVCマウスケージに収容しました。 材料表 には、このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関する詳細情報が含まれています。

1. ヒト骨肉腫組織の調製

注:この研究では、化学療法の前に15歳の骨肉腫患者の大腿骨病変からヒト骨肉腫組織12 を切除しました。

  1. 切除したばかりの骨肉腫組織を直ちに組織保護溶液に保管し、滅菌生理食塩水ですすいだ後、骨肉腫細胞の活性化を最大限に保存します。
    注:切除したばかりの骨肉腫組織は、できるだけ早くマウスに移植する必要があります。それらは、移植前に最大24時間組織保護溶液に保存できます。モデリングに使用する骨肉腫組織は、化学療法を受けていない患者からのものでなければなりません。化学療法を受けた患者の腫瘍細胞の活性は悪くなり、モデル確立の失敗と高い忠実度の喪失につながります。
  2. 組織保護液に保存されている切除したばかりの骨肉腫組織をできるだけ早く検査室に移します。.
  3. PDXモデルを確立するための実験器具と材料を準備します:メス(図1A)。眼科用ピンセット(図1B、C);眼科用ハサミ(図1D);縫合針(図1E);縫合線(図1F);ストレートニードルホルダー(図1G);マーキングペン(図1H)。
    注:使用前に、すべての手術器具がオートクレーブ滅菌されていることを確認してください。
  4. 滅菌フード内で、予冷した滅菌生理食塩水で骨肉腫組織を2回すすぎます。
  5. 出血や壊死のある骨肉腫組織の領域を切除します。
  6. 洗浄した骨肉腫組織を、予冷した滅菌生理食塩水を入れた培養皿にメスを入れて3mm3 等分に切り、氷上に保ちます。

2. マウス脇腹領域における骨肉腫組織移植によるPDXモデルの確立

  1. メロキシカム(5 mg / kg / 24時間)の術前鎮痛をマウスの皮下注射で投与し、ヌードマウスを滅菌外科用ドレープに置きます。.手順全体を通して熱サポートを提供します。
  2. マウスを3%イソフルランと97%酸素に曝露することにより、マウスに麻酔を誘発します。マウスを完全に麻酔した後、マウスをノーズコーンに移し、1.5%イソフルランと98.5%酸素で麻酔を維持します。
  3. つま先をつまんでマウスが完全に麻酔をかけられていることを確認し、まだけいれんやけいれん反応がある場合は長く待ちます。
    注:すべての手順は、滅菌フード内の滅菌機器を使用して実行する必要があります。麻酔中のマウスの乾燥を避けるために、眼科用軟膏をマウスの目に塗布します。.
  4. マウスを横方向の褥瘡位置に固定します(図2A)。骨肉腫組織移植のためにマウスの脇腹領域の片側を、ポビドンヨードと70%エタノール消毒剤のコットンボールを交互に3回消毒します。
    注:外科的消毒は、中央から始まり外側にらせん状に円形のパターンで行われます。
  5. マーカーペンで皮膚の外科的切開部位に印を付けます。
  6. メスで皮膚から皮下組織まで5mmの切開を行います(図2B)。
  7. 左手の眼科用ピンセットで切開縁の上側の皮膚を持ち上げ、右手のまっすぐな針ホルダーでマウスの真皮の下を上向きに鈍的解剖します(図2C)。
  8. 左手の眼科用ピンセットで切開部の上側の皮膚を押さえ、右手で眼科用ピンセットで切開縁の約5mm上の皮下に骨肉腫組織を移植します(図2C)。
    注:骨肉腫組織が皮膚の真皮のすぐ下に移植されていることを確認してください。鈍的解剖は、マウスの皮膚の真皮層を見つけながらマウスの胸腔を貫通するのを避けるために、まっすぐな針ホルダーなどのまっすぐで鈍い解剖鉗子を使用して行われます。
  9. 5 mm の切開に対して 2-3 針の吸収性縫合糸を使用して切開部を縫合します (図 2D)。
  10. マウスを清潔なケージに戻し、麻酔から完全に回復するまでマウスを監視します。
    注:ヒト骨肉腫組織を移植して確立したPDXは継代0(P0)と指定し、P0にPDX組織を移植して確立したPDXは継代1(P1)と指定し、その後にP2とP3を示します。

3. PDX腫瘍組織の採取

  1. 週に一度、腫瘍の体積を測定します。腫瘍サイズが1500 mm3に達したら、CO2 吸入後に子宮頸部脱臼法を使用してマウスを安楽死させます。人道的なエンドポイントには、腫瘍潰瘍形成や前肢の可動性の問題が含まれます。
    注:キャリパーを使用して、腫瘍の長径(a)と短径(b)を測定します。式を使用して腫瘍体積(V)を計算します:V = 1/2 × a × b2。
  2. マウスを横向きにして腫瘍を露出させ、アルコールに浸したコットンボールで腫瘍部位の皮膚を消毒します。
  3. 眼科用ハサミを使用して腫瘍全体を分離します。電子スケールを使用して腫瘍塊を計量します。

4. 原発性臨床組織およびPDX腫瘍組織の病理学的検査

  1. 腫瘍組織13 を、30mLの10%中性緩衝ホルマリン溶液を含む50mLチューブに24時間固定する。腫瘍組織を流水で十分にすすぎ、固定剤を取り除きます。
  2. 腫瘍組織を脱水し、パラフィン14に埋め込みます。
  3. 腫瘍組織をスライスし、定期的な組織学的検査を実施します15。

結果

このプロトコルは、PDXマウスモデルを確立するための詳細な手順を説明し、新たに切除されたヒト骨肉腫組織の即時移植とマウスでの連続継代後のヒト骨肉腫の形態学的特徴を保存します。今回、ヒト骨肉腫組織を用いてPDXマウスモデルを確立することに成功しました。

図3A は、15歳の患者から大腿骨肉腫組織を移植した2?...

ディスカッション

PDXモデルは、ヒトの癌の特性をシミュレートし、遺伝的およびゲノム的変化、組織型、不均一性、および遺伝子発現プロファイル16,17,18,19を含む原発腫瘍との類似性をより保持することができる。したがって、彼らは癌患者の分子表現型と遺伝子型を保存し、生物学を研?...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、(1)国立自然科学財団(81973877および82174408)からの助成金によってサポートされています。(2)上海最優先研究センター建設プロジェクト(2022ZZ01009);(3)中国の国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600);(4)上海コラボレーティブイノベーションセンター、病院TCM準備の産業変革、および(5)上海伝統中国医学大学の予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin neutral solutionWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500mlFix the tissues
AutoclaveJapan Hiryama CompanyHVE-50Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./Animal
CaliperYantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180AMeasure the tumor volume
Dish (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, CorningSample placment during transplantation
Disinfectant cotton ballsShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Disinfect the skin of mice
Disposable sterile glovesGuilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent DietSuzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3Animal feed
Electronic scaleShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000Weigh the weight of the tumor
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYMouse anesthesia 
IVCs mice cageSuzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Animal barrier
Mark penZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Mark the surgical incision
Olympus Optical microscopeJapanese Olympus CompanyBH20Scan tissue slices
Ophthalmic ointmentShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRLAvoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissorsShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCut the skin
Ophthalmic tweezersShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpHold osteosarcoma tissues during transplantation
ParaffinJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machineLyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235Osteosarcoma tissue section
physiological salineGuangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.605-004057Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
ScalpelsSurgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZSeparation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hoodThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Surgical operation table
sterile surgical drapesHenan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090Provide sterile surgery area
Straight needle holderShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZSuture the wound
Suture lineShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Suture needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Tissue protective solutionNanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Install formalin fixation solution

参考文献

  1. Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4 (2018).
  2. Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772 (2021).
  3. Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045 (2019).
  4. Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352 (2021).
  5. Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
  6. Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
  7. Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
  8. Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
  9. Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41 (2022).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  11. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4 (2020).
  12. Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5 (2017).
  13. Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
  14. Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162 (2023).
  15. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
  16. de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
  17. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  18. Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
  19. Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  20. Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
  21. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
  22. Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206 (2022).
  23. Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63 (2022).
  24. Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911 (2022).
  25. Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
  26. Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved