نوضح طريقة تستفيد من الفحص المجهري متحد البؤر للمسح السريع لإجراء تصوير مباشر لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لسمك الزرد النامي ، مما يسمح بتحليل ديناميكيات هذه الخلايا في الجسم الحي.
الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا ديناميكية للغاية وهجرتها واستعمار حمة الدماغ هي خطوة حاسمة لنمو الدماغ ووظيفته بشكل صحيح. تمتلك أجنة الزرد النامية خارجيا شفافية بصرية ، والتي إلى جانب خطوط مراسل معدلة وراثيا جيدة المواصفات التي تصف الخلايا الدبقية الصغيرة بالفلورسنت ، تجعل الزرد نموذجا مثاليا للفقاريات لمثل هذه الدراسات. في هذه الورقة ، نستفيد من الميزات الفريدة لنموذج الزرد لتصور ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي وتحت الظروف الفسيولوجية. نستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لتسجيل الفاصل الزمني لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لجنين الزرد ، ثم استخراج بيانات التتبع باستخدام برنامج IMARIS 10.0 للحصول على مسار هجرة الخلايا ومتوسط السرعة والتوزيع في القفص البصري في مراحل النمو المختلفة. يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة مفيدة لتوضيح الأهمية الفسيولوجية لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة في سياقات مختلفة ، مما يساهم في توصيف أعمق لهذه الخلايا شديدة الحركة.
باعتبارها بلاعم مقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة متميزة غير عصبية تمثل ما يصل إلى 15٪ من جميع الخلايا الدبقية في الدماغ البالغ. اكتسبت دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة بسبب أهميتها الراسخة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء والمرض1. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الخلايا الدبقية الصغيرة ديناميكية للغاية ، وتقوم باستمرار بمسح حمة الدماغ 2,3. يسمح هذا السلوك للخلايا الدبقية الصغيرة باستعمار الدماغ ولعب أدوار محورية في تطوره مثل تشكيل الدوائر العصبية4 ، والتقليم المشبكي5 ، وتكوين الأوعية الدموية6. علاوة على ذلك ، تسمح هذه الطبيعة الديناميكية المتأصلة للخلايا الدبقية الصغيرة بمراقبة الجهاز العصبي المركزي باستمرار بحثا عن علامات العدوى أو الإصابة أو أي انحرافات عن التوازن7. لتشريح ديناميكيات الخلايا المعقدة هذه ، لا غنى عن التصوير الحي للخلايا الدبقية الصغيرة عبر المكان والزمان. لحسن الحظ ، فإن الشفافية البصرية لأجنة الزرد النامية خارجيا ، إلى جانب توفر خطوط مراسلة معدلة وراثيا جيدة المواصفات والتي تصف الخلايا الدبقية الصغيرة بالفلورسنت ، تضع الزرد كنموذج مثالي للفقاريات لمثل هذه التحقيقات. يوفر التصوير الحي في أجنة الزرد نهجا غير جراحي لا يتطلب جراحة أو معالجة واسعة النطاق للأنسجة، مما يقلل من الاضطرابات المحتملة لحالة الجهاز العصبي المركزي. هذا اعتبار حاسم عند دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة ، لأنها حساسة للغاية حتى للتغيرات الطفيفة في البيئة خارج الخلية8.
هنا ، نقدم إرشادات لتتبع حركات الخلايا الدبقية الصغيرة 3D بنجاح في جنين الزرد ، مما يسمح برؤية غير مسبوقة لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة داخل البنية السليمة لحمة الدماغ النامية (انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة رسومية للبروتوكول). يوضح هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيفية إعداد وتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة لأسماك الزرد في مراحل النمو المختلفة وكيفية استخراج بيانات عالية الدقة حول حركة الخلايا الدبقية الصغيرة لتوفير رؤى قيمة حول أنماط هجرتها واستجاباتها للإشارات البيئية. نوضح أيضا أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول لإجراء تصوير حي متعدد الألوان ، وبالتالي توسيع نطاق تطبيقه لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة مع الخطوط المعدلة وراثيا التي تميز الخلايا المجاورة ، بما في ذلك الخلايا العصبية3 ، والخلايا قليلة التغصن9 ، والخلايا البطانية10 (كما هو موضح في الشكل 2). من خلال الإضافة إلى صندوق الأدوات الذي يسمح للمرء بمراقبة وتوصيف ديناميكيات سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل مباشر في الوقت الفعلي وفي بيئتها الطبيعية ، من المحتمل أن يساهم هذا البروتوكول في توضيح وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل أثناء التطور المبكر ، سواء في علم وظائف الأعضاء أو المرض.
وقد تم الحفاظ على سمك الزرد في ظل ظروف قياسية، وفقا لما ذكره FELASA42 والمؤسسات (جامعة بروكسل الحرة، بروكسل، بلجيكا؛ وجامعة بروكسل الحرة، بروكسل، بلجيكا). ULB) المبادئ التوجيهية واللوائح. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة الأخلاقية لرعاية ULB (CEBEA) من ULB.
1. تربية الزرد وإعداد الأجنة
ملاحظة: تم استخدام الخط المعدل وراثيا لسمك الزرد Tg (mpeg1: eGFP) gl22 الذي يعبر عن بروتين eGFP الفلوري في الضامة ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، لتوليد بيانات التتبع الموضحة في هذا البروتوكول. تتوفر خطوط مراسل البلاعم الأخرى من ZIRC ويمكن استخدامها أيضا. عند اختيار الخط المعدل وراثيا ، من المهم مراعاة أن شدة الإشارة العالية ستسهل الحصول على الصور وتجزئة الخلايا.
2. تصاعد الزرد
3. تحليل التتبع وتصدير البيانات
الخلايا الدبقية الصغيرة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (eGFP) والخلايا البطانية التي تعبر عن DsRed في Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL: كريS898; actb2: loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) تم تصوير الأجنة المحورة وراثياالثلاثية 14 عند 3 dpf ، وفقا للبروتوكول الموصوف. تم تركيب جنين واحد من الزرد في أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1٪ على صفيحة زجاجية سفلية ولم تعيق عملية التصوير نمو الجنين خلال فترة الاستحواذ. تم تسجيل الفاصل الزمني باستخدام نظام مجهر متحد البؤر لمسح النقاط التجارية مزود بعدسة موضوعية جافة 10x 0.45 NA ، وتم استخدام ليزر إثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر لتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان الفاصل الزمني ودقة الصورة وحجم البكسل والخطوة z 30 ثانية (ثوان) و 1024 × 1024 و 0.49 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر على التوالي. استمر تسجيل الفاصل الزمني 3.5 ساعة (ساعة).
غطى مجال الرؤية المكتسب رأس الجنين بالكامل ، لكن التحليل ركز بشكل خاص على القفص البصري ، حيث أنه خلال الأسبوع الأول من التطور ، تقتصر الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أساسي على طبقة سوما العصبية في هذه المنطقة من الدماغ المتوسط الظهري ، مما يسمح للمحققين بتصور جميع السكان في وقت واحد15. تم إجراء تحليل التتبع ثلاثي الأبعاد باستخدام Imaris 10.0 ، كما هو موضح أعلاه. كما هو موضح في الشكل 4 ، كان التتبع ناجحا ، مما أدى إلى 25 مسارا ، مطابقة للعدد المتوقع لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة في القفص البصري عند 3 dpf16. كان مطلوبا الحد الأدنى من تصحيح المسارات اليدوية. يوضح الشكل 5 مثالا على البيانات التي يمكن استخراجها من تجربة تتبع ناجحة. يسمح وضع العلامات المتزامنة للبلاعم والخلايا البطانية بتحديد موضع الخلايا الدبقية الصغيرة بالنسبة للأخيرة ، مما يسمح للباحثين بتصور المسافة النسبية لكل خلية إلى أقرب خلية بطانية في الوقت المناسب وفحص تواتر وعدد التفاعلات المحتملة (الشكل 5).
الشكل 1: نظرة عامة على الإجراء التجريبي. أ: تحضير جنين الزرد وتخديره. (ب) تركيب العينة وتحديد موضعها. (ج) الحصول على الصور. (د) معالجة الصور واستخراج بيانات الحركة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة والتفاعلات مع البيئة الخلوية للدماغ في جنين الزرد. (أ) صورة برايتفيلد لرأس ودماغ سمكة الزرد الجنينية 3 dpf (منظر ظهري) ، مع تسمية القفص البصري والدماغ الخلفي. يمكن تصوير دماغ الزرد الجنيني بالكامل في هذه المرحلة نظرا لصغر حجمه وشفافيته البصرية. (ب-د) يمكن تصور موقع الخلايا الدبقية الصغيرة وسلوكها باستخدام خطوط معدلة وراثيا مثل (B ، C) Tg (mpeg1: eGFP) gl22 و (D) Tg (mpeg1: mcherry) gl23 ، والتركيز على OT. (ب) يمكن التعرف على الخلايا العصبية وأجسامها الخلوية باستخدام الخط المراسل Tg(XlTubb:D sRed)zf148 ، ويمكن تصور التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية عن طريق دمج القناتين في خطوط تعبر عن كلا الجينين المحورين. ينظر إلى دمج الإشارات الخضراء (الخلايا الدبقية الصغيرة) والحمراء (الخلايا العصبية ، باللون الأرجواني). (ج، د) يمكن لخطوط المراسل أيضا إلقاء الضوء على تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة (باللون الأخضر) مع الخلايا البطانية ، هنا باللون الأحمر باستخدام (C) مزدوج Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) المعدلة وراثيا، أو مع الخلايا الدبقية مثل الخلايا قليلة التغصن وسلائفها، باستخدام (D) مزدوج Tg(olig2:EGFP; MPEG1: mCherry ) خط معدل وراثيا. 1: oligodendrocytes والخلايا السلفية في OT ، 2: الخلايا العصبية eurydendroid في المخيخ. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب. OT = القفص البصري ؛ HB = الدماغ الخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التباين المورفولوجي والمكاني بين بلاعم الجلد والخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد 3 dpf. (أ ، ب) منظر ظهري لجنين الزرد Tg (mpeg1: eGFP) gl22 عند 3 dpf ، يصور (A) خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة المتنية (المميزة بالعلامات النجمية الأرجواني) مقابل الضامة الجلدية (العلامات النجمية البيضاء) ، والتي تم تحديدها بناء على موقعها النسبي على طول المحور z ، كما هو موضح في (B) ، والذي يعرض صورة 3D أحادية اللون معروضة مع ترميز ألوان المحور z. (ج، د) منظر جانبي ل (C) A و (D) B ، يعرض أعماق z لخلايا mpeg1: eGFP + داخل رأس الجنين ويسلط الضوء على التوطين السطحي لبلاعم الجلد مقارنة بالخلايا الدبقية الصغيرة. (E-K) تكبير عالي لكل خلية يشار إليها بعلامة النجمة في A و B ، مما يوفر تصورا مفصلا للأشكال المميزة بين الخلايا الدبقية الصغيرة الأميبية (E-G) والبلاعم الجلدية الممدودة (H-K). قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. اختصار: dpf = أيام بعد الإخصاب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تتبع الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد 3 dpf. (أ) منظر ظهري للرأس ل 3 dpf Tg(kdrl:cres898; Actb2: لوكسب-ستوب-لوكسب-دسريداكسبرس,SD5; mpeg1: eGFPgl22) جنين ثلاثي معدل وراثيا ، يظهر الخلايا الدبقية الصغيرة (الخضراء) والتجسيد السطحي للأوعية (أرجواني). (ب-د) تتبع تمثيلي لحركات الخلايا الدبقية الصغيرة خلال فترة زمنية (B) 3.5 ساعة. ينظر إلى الخلايا الفردية على أنها تتبع مسارات معقدة. (ج) تفاصيل من الفاصل الزمني، تظهر منظرا مكبرا للمنطقة في B محاطا بالمربع المتقطع. يتم تقديم ستة إطارات من الفيلم (45 دقيقة) ، توثق الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنشئ اتصالات عابرة مع الخلايا البطانية في بيئتها المكروية. (د) مسارات هجرة الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية داخل الحاجز البصري، حيث تمثل المحاور X وY وZ أبعادا مكانية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: dpf = أيام بعد الإخصاب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصور البيانات التي تم الحصول عليها. مثال على البيانات المكانية التي يمكن الحصول عليها باستخدام البروتوكول الموصوف. توضح التمثيلات البيانية (أ) السرعة المتوسطة للخلايا الدبقية الصغيرة، (ب) متوسط المسافة التي تقطعها في 1 h، (ج) متوسط إزاحتها التربيعية، (د) توزيعها في الفضاء في أزمنة مختلفة. سمح تجسيد سطح الوعاء أيضا بقياس أقصر مسافة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية في أي وقت ، سواء على مستوى الخلية الواحدة (E) أو كمتوسط عالمي (F). بالنسبة إلى A و B و D ، تمثل كل نقطة خلية فردية. N = جنين واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
يتيح البروتوكول الحالي التصوير في الجسم الحي لديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الفقاريات وتصور بيانات الحركة المكتسبة. يحدث استعمار الخلايا الدبقية الصغيرة للدماغ النامي في وقت مبكر جدا أثناء التطور الجنيني ويسبق الأحداث الحرجة مثل قمم تكوين الخلايا العصبية ، وتكوين الخلايا النجمية ، وتكوين القلة ، والعديد من العمليات الخلوية الأخرى17. لذلك ليس من المستغرب أن تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة وظائف مهمة في تشكيل جوانب محددة من نمو الدماغ18 ، على سبيل المثال ، من خلال تنظيم التمايز العصبي والهجرة والبقاء على قيد الحياة19،20،21 ، وكذلك التقليم المشبكي5 والميالين22،23،24.
كما يتم التعرف بشكل متزايد على مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفيا في التسبب في اضطرابات النمو العصبي و / أو تطورها25. في الواقع ، فإن الوجود المبكر للخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ المتشكل يعرض هذه الخلايا لحالات فسيولوجية مميزة26 والتغيرات البيئية. يمكن أن يكون لهذا تأثير كبير بالنظر إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا طويلة العمر في كل من القوارض والبشر ، ويتم الحفاظ عليها خلال العمر من خلال التجديد الذاتي للأسلاف المحليين27،28،29. نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون بمثابة أداة قوية لتوصيف سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل في هذه الحالات الفسيولوجية المتميزة ، حيث تتطور وتنضج وتؤسس شبكتها خلال الخطوات المتتالية لتشكل الدماغ.
باستخدام الإعداد الموصوف هنا ، نجحنا في تصوير واكتساب بيانات عن يرقات الزرد التي يبلغ عمرها 6 dpf. من المحتمل أن ينجح توسيع نطاق التحليل ليشمل مراحل التطوير اللاحقة ولكنه سيتطلب تعديل إعداد التصوير لمراعاة حجم العينة المتزايد ، خاصة على طول المحور z. عند محاولة ذلك ، نقترح التركيز على الحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة ووقت مسح سريع ، لأنها معلمات أساسية لتحليل ناجح.
نقترح الحد الأدنى من وقت التصوير من 1 ساعة للسماح بتتبع الخلايا الدبقية الصغيرة. أطول نافذة تصوير تم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول هي 8 ساعات. علاوة على ذلك ، من المهم أن يحافظ تحليل التتبع على الفاصل الزمني بين الإطارات قصيرا قدر الإمكان ، من الناحية المثالية بين 30 ثانية و 60 ثانية. سيسمح ذلك ببيانات تتبع أكثر دقة وتفصيلا في تحليلات المصب. لذلك ، خاصة في حالة اكتشاف أكثر من فلوروفور واحد ، من الضروري تجنب التداخل الطيفي وضمان الفصل الكافي بين طيفي انبعاث الفلوروفور للسماح باكتساب متزامن ، دون نزيف الإشارة.
تتوفر بروتوكولات أخرى لتسجيل الفاصل الزمني عالي الجودة لدماغ الزرد30 ، ولكن هذا هو البروتوكول الأول الذي يوضح كيفية تتبع جميع حركات الخلايا الدبقية الصغيرة بنجاح أثناء التطور الجنيني على مدى فترة طويلة. على الرغم من أن سير العمل المقدم هنا ركز على تتبع الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق فسيولوجي ، إلا أنه يمكن تطبيقه بسهولة على تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة في علم الأمراض. في الواقع ، تم إنشاء العديد من نماذج اضطرابات النمو العصبي ، مثل التوحد31 ، والصرع32 ، والفصام33 ، ولكن أيضا التنكس العصبي34 والسرطان35 ، في الزرد التي توفر فرصا فريدة لتحديد الاستجابة والسلوك الدبقي الصغير في حالات المرض.
والجدير بالذكر أن بروتوكول التتبع هذا متعدد الاستخدامات ويمكن أن يكون مفيدا أيضا لإلقاء الضوء على أنماط الهجرة لأنواع مختلفة من الخلايا عبر مناطق تشريحية متنوعة من جنين الزرد ، مما قد يفتح سبلا لتطبيقات إضافية ، خارج نطاق التحقيق الدبقي الصغير الموصوف في هذه المقالة. علاوة على ذلك ، من خلال تسخير القدرة على الجمع بين خطوط محورة وراثيا فلورية متعددة ، نكتسب القدرة على تمييز العلاقة المكانية بين الخلايا الدبقية الصغيرة وأنواع الخلايا الأخرى في البيئة الدقيقة للدماغ ، مع إمكانية تصور التفاعلات الخلوية والمحادثات المتقاطعة عبر تسجيلات الفاصل الزمني ، بطريقة غير جراحية. يمكن أن يكون هذا مفيدا في كشف الأهمية الفسيولوجية لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة والمساهمة في توصيف أعمق لهذه الخلايا شديدة الحركة.
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
يود المؤلفون أن يعربوا عن خالص امتنانهم للبروفيسور نيكولاس باينز لتوفيره بسخاء الوصول إلى المجهر متحد البؤر الضروري لهذه الدراسة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل صناديق البحث العلمي (FNRS) بموجب أرقام المنح F451218F و UG03019F ، ومؤسسة أبحاث الزهايمر (SAO-FRA) (إلى VW) ، يتم دعم AM من خلال زمالة بحثية من FNRS. تم إنشاء الشكل 1 على biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
teasing needle | avantor | 76549-024 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved