Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكول الرحلان الكهربائي لهلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين ل Sipunculus nudus بسرعة.

Abstract

تم استخدام عوامل تحلل الفيبرينوجين التي يمكنها إذابة الفيبرينوجين مباشرة على نطاق واسع في العلاج المضاد للتخثر. بشكل عام ، يتطلب تحديد عوامل تحلل الفيبرين الجديدة فصل كل مكون أولا ثم التحقق من أنشطته المحللة للفيبرين. حاليا ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) والكروماتوغرافيا في الغالب في مرحلة الفصل. وفي الوقت نفسه ، عادة ما يتم اعتماد مقايسة لوحة الفيبرينوجين ومنتجات التفاعل القائمة على PAGE لعرض أنشطتها في تحلل الفيبرينوجين. ومع ذلك ، بسبب الفصل الزماني المكاني لهاتين المرحلتين ، من المستحيل فصل وعرض عوامل تحلل الفيبرين النشطة بنفس الجل. لتبسيط عمليات الفصل والعرض لتحديد عامل تحلل الفيبرين ، قمنا ببناء طريقة جديدة ل fibrinogen-PAGE لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرينوجين لديدان الفول السوداني (Sipunculus nudus) في هذه الدراسة. تتضمن هذه الطريقة تحضير الفيبرينوجين-PAGE ، والرحلان الكهربائي ، وإعادة التجديد ، والحضانة ، والتلوين ، وإزالة اللون. يمكن الكشف عن نشاط تحلل الفيبرين والوزن الجزيئي للبروتين في وقت واحد. وفقا لهذه الطريقة ، نجحنا في اكتشاف أكثر من عامل نشط لتحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني في غضون 6 ساعات. علاوة على ذلك ، فإن طريقة fibrinogen-PAGE هذه مناسبة للوقت والتكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العوامل المحللة للفيبرين للكائنات الحية الأخرى.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، بسبب الارتفاع المستمر في أمراض التخثر ، أصبحت أمراض التخثر مشكلة صحية عالمية رئيسية جديدة1. في الوقت الحاضر ، يتم تصنيف الأدوية المضادة للتخثر إلى ثلاث مجموعات: الأدوية المضادة لتراكم الصفائح الدموية ، ومضادات التخثر ، وأدوية التخثر. من بينها ، الأدوية الخثارية ، مثل urokinase (المملكة المتحدة) ، منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) ، وما إلى ذلك ، هي الأدوية الوحيدة المستخدمة سريريا التي يمكنها تحلل الجلطة2. وفي الوقت نفسه ، يتم تطوير أدوية أكثر أمانا وفعالية للتخثر من خلال تحديد عوامل التخثر الجديدة3.

ومع ذلك ، فإن تحديد عوامل التخثر الجديدة يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة ، والتي تنطوي بشكل أساسي على مراحل الفصل / التنقية والتوصيف / الفحص. الأول هو فصل كل مكون ، والأخير هو عرض أنشطتهم الفيبرينو (geno) lytic 4,5. في الدراسات السابقة ، على الرغم من حقيقة أننا نجحنا في عزل إنزيم فيبرينو (جينو) لاتيك جديد (sFE) من دودة الفول السوداني (Sipunculus nudus) عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ومقايسة لوحة الفيبرين (الجين)6،7،8 ، فإن هذه العمليات تستغرق وقتا طويلا وتستغرق عمالة. أولا ، من الضروري تحديد ما إذا كانت متجانسات دودة الفول السوداني لها نشاط تحلل الفيبرينو (الجينو) بواسطة طريقة لوحة الفيبرين (الجين) ومنتجات التفاعل بناء على الصفحة9. بعد ذلك ، يجب إجراء سلسلة من الكروماتوغرافيا ، مثل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، وكروماتوغرافيا التقارب ، وطرق أخرى ، للفصل والتنقية10,11. بعد ذلك ، يتم إجراء فحص لوحة الفيبرين مرة أخرى للتحقق من نشاط تحلل الفيبرين لكل مكون منفصل. أخيرا ، يتم إجراء PAGE الأصلي وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) -PAGE لتحديد الوزن الجزيئي للعوامل المحللة للفيبرين النشطة12. لذلك ، من الأهمية بمكان فصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة بسرعة.

لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة بسرعة في متجانسات دودة الفول السوداني ، تم تطوير طريقة جديدة ل fibrinogen-PAGE من خلال الجمع بين طرق PAGE ولوحة الفيبرينوجين ، أي تمت إضافة ركائز عوامل تحلل الفيبرينوجين الفيبرينوجين إلى هلام PAGE الأصلي. بعد الصفحة الأصلية ، تم فصل المكونات حسب وزنها الجزيئي. وفي الوقت نفسه ، يمكن عرض كل مكون نشط من مكونات تحلل الفيبرين عن طريق تلطيخ. بهذه الطريقة ، اكتشفنا بنجاح أكثر من عامل نشط للفيبرين من تجانس دودة الفول السوداني في غضون 6 ساعات. علاوة على ذلك ، فإن طريقة fibrinogen-PAGE هذه مناسبة للوقت والتكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العوامل المحللة للفيبرين للكائنات الحية الأخرى.

Protocol

1. تحضير متجانسة دودة الفول السوداني

  1. أضف 50 جم من ديدان الفول السوداني و 150 مل من المحلول الملحي في الخالط.
  2. تجانس عند 24000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.
    ملاحظة: كرر 3 مرات.
  3. جهاز الطرد المركزي المجانس عند 9710 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. جمع الطافية كما تجانس دودة الفول السوداني لمزيد من الدراسة.

2. إعداد هلام الفيبرينوجين بيج

  1. وزن 0.01 g من الفيبرينوجين في كأس زجاجية سعة 50 mL.
  2. أضف 1.9 مل من DDH2O ، 1.3 مل من Tris-HCl (1.5 M ، درجة الحموضة 8.8) ، و 0.05 مل من SDS (10٪ ، w / v) في الدورق ؛ تخلط جيدا عن طريق الماصة.
  3. توضع الدورق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي إذابة الفيبرينوجين.
  4. أضف 1.7 مل من مادة الأكريلاميد (30٪ ، وزن / حجم) ، 0.05 مل من بيرسلفات الأمونيوم (APS ؛ 10٪ ، وزن / حجم) ، 0.002 مل من TEMED ؛ تخلط جيدا عن طريق الماصة.
    ملاحظة: هذا هو فصل الجل.
  5. صب هلام الفصل في قالب هلام 10 آبار.
  6. أضف 2 مل من DDH2O في قالب الهلام ؛ انتظر لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بإزالة الماء جيدا عن طريق قلب القالب رأسا على عقب.
  8. إضافة 1.4 مل من DDH2O ، 0.25 مل من Tris-HCl (1.0 M ، درجة الحموضة 6.8) ، 0.02 مل من SDS (10٪ ، وزن / حجم) ، 0.33 مل من مادة الأكريلاميد (30٪ ، وزن / ت) ، 0.02 مل من APS (10٪ ، وزن / ت) ، 0.002 مل من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) في الدورق ؛ تخلط جيدا عن طريق الماصة.
    ملاحظة: هذا هو تحميل هلام.
  9. صب جل التحميل في نفس قالب الجل مثل الخطوة 2.5 ؛ أدخل المشط على الفور.
    ملاحظة: يتكون هلام الفيبرينوجين-PAGE المستخدم هنا من الفيبرينوجين (0.2٪) الذي يحتوي على هلام الفصل وهلام التحميل. يمكن تعديل تركيز الفيبرينوجين حسب الحاجة.

3. الكهربائي

  1. ضع هلام fibrinogen-PAGE المحضر مع قالب الغراء في خزان الرحلان الكهربائي ؛ صب 1300 مل من محلول الرحلان الكهربائي (1.963 جم من تريس ، 12.22 جم من الجلايسين ، 0.65 جم من SDS ، و 1300 مل من DDH2O) في الخزان ؛ اخراج المشط.
  2. أضف 5 ميكرولتر من 5x مخزن تحميل غير مسخ إلى 20 ميكرولتر من sFE و 20 ميكرولتر من تجانس دودة الفول السوداني ؛ تخلط جيدا عن طريق الماصة. قم بتحميلها في هلام الفيبرينوجين PAGE المحضر.
    ملاحظة: لا تغلي الخليط. sFE هو إنزيم تحلل الفيبرينو (geno) الذي تم تحديده سابقا6،7،8 ويستخدم كعنصر تحكم إيجابي في هذه الدراسة. تجانس دودة الفول السوداني هو العينة التي سيتم اكتشافها. مخزن تحميل غير مسخ بدون بروموفينول أزرق ، β-ميركابتوإيثانول ، و SDS مقارنة بمخزن التحميل SDS-PAGE. يتم فصل كل حارة عينة مع المخزن المؤقت للتحميل 1x SDS-PAGE للكشف بوضوح عن حركة البروتين.
  3. أداء الكهربائي عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة ، أو 120 فولت لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بإزالة هلام الفيبرينوجين-بيج من قالب الغراء.

4. إعادة التشكيل

  1. انقل هلام الفيبرينوجين-بيج إلى صندوق بلاستيكي.
  2. أضف 100 مل من Tris-HCl (0.05 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4) و 2 مل من Triton X-100 في الصندوق. ضعه على شاكر عند 60-70 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل عن طريق الماصة.
    ملاحظة: كرر ثلاث مرات.

5. الحضانة

  1. أضف 50 مل من Tris-HCl (0.05 م ، درجة الحموضة 7.4) في الصندوق البلاستيكي.
  2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: يمكن تعديل وقت الحضانة وفقا لقوة نشاط تحلل الفيبرين.

6. تلطيخ

  1. قم بإزالة المخزن المؤقت للحضانة عن طريق الماصة.
  2. أضف 50 مل من محلول Coomassie Brillant Blue Staining في الصندوق وضع الصندوق على شاكر عند 60-70 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

7. إزالة اللون

  1. قم بإزالة محلول التلوين عن طريق الماصة.
  2. أضف 50 مل من DDH2O في الصندوق.
  3. ضع الصندوق على شاكر عند 60-70 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تم استخدام DD H2O كمحلول لإزالة البقع هنا. يمكن ضبط وقت الاهتزاز وفقا لقوة نشاط تحلل الفيبرين.

النتائج

بعد الكهربائي ، تم عرض جميع نطاقات العلامة بوضوح. أظهرت ممرات التحميل 1x SDS-PAGE نطاقات 10 كيلو دالتون فقط (بروموفينول أزرق). لم تظهر عينات sFE ودودة الفول السوداني أي نطاقات يمكن ملاحظتها (الشكل 1). على الرغم من أن نطاقات العينات غير مرئية ، إلا أن أداء العلامة وا...

Discussion

sFE هو إنزيم فيبرينو (جينو) لاتيك جديد معزول من ديدان الفول السوداني من قبل فريقنا سابقا3،6،8،13. ومع ذلك ، كانت عمليات تحديد sFE تستغرق وقتا وعمالة ، بما في ذلك اكتشاف نشاط تحلل الفيبرين ، وفصل مكونات البرو...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (رقم 3502Z20227197) ، ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070; No. 2022J01311) ، ومشروع ابتكار المواهب وريادة الأعمال رفيع المستوى لخطة تشيوانتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2022C015R). نشكر Fucai Wang (جامعة Huaqiao) ولي تونغ (جامعة Huaqiao) على مساعدتهما الفنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamideBiosharpBL513B
Ammonium persulfateXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
BeakerPYREX2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)BiosharpBS-15-M
Constant Temperature IncubatorJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solutionBeyotimeP0017F
Electronic Analytical BalanceDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Gel loading pipette tips, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogenizerAHSATS-1500
Horizontal rotation oscillatorNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
Pipette Tip (1 mL)AxygeneT-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)AxygeneT-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)AxygeneT-200XT-C
Pipettor (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
Pipettor (10µL)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipettor (200 µL)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipettor (50 µL)Thermo Fisher ScientificZY15331
Refrigerated CentrifugecenceH1650R
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200

References

  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
  8. . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
  13. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PAGE Sipunculus Nudus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved