الفصل السريع وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة في Sipunculus nudus من خلال هلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد الكهربائي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكول الرحلان الكهربائي لهلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين ل Sipunculus nudus بسرعة.

Abstract

تم استخدام عوامل تحلل الفيبرينوجين التي يمكنها إذابة الفيبرينوجين مباشرة على نطاق واسع في العلاج المضاد للتخثر. بشكل عام ، يتطلب تحديد عوامل تحلل الفيبرين الجديدة فصل كل مكون أولا ثم التحقق من أنشطته المحللة للفيبرين. حاليا ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) والكروماتوغرافيا في الغالب في مرحلة الفصل. وفي الوقت نفسه ، عادة ما يتم اعتماد مقايسة لوحة الفيبرينوجين ومنتجات التفاعل القائمة على PAGE لعرض أنشطتها في تحلل الفيبرينوجين. ومع ذلك ، بسبب الفصل الزماني المكاني لهاتين المرحلتين ، من المستحيل فصل وعرض عوامل تحلل الفيبرين النشطة بنفس الجل. لتبسيط عمليات الفصل والعرض لتحديد عامل تحلل الفيبرين ، قمنا ببناء طريقة جديدة ل fibrinogen-PAGE لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرينوجين لديدان الفول السوداني (Sipunculus nudus) في هذه الدراسة. تتضمن هذه الطريقة تحضير الفيبرينوجين-PAGE ، والرحلان الكهربائي ، وإعادة التجديد ، والحضانة ، والتلوين ، وإزالة اللون. يمكن الكشف عن نشاط تحلل الفيبرين والوزن الجزيئي للبروتين في وقت واحد. وفقا لهذه الطريقة ، نجحنا في اكتشاف أكثر من عامل نشط لتحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني في غضون 6 ساعات. علاوة على ذلك ، فإن طريقة fibrinogen-PAGE هذه مناسبة للوقت والتكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العوامل المحللة للفيبرين للكائنات الحية الأخرى.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، بسبب الارتفاع المستمر في أمراض التخثر ، أصبحت أمراض التخثر مشكلة صحية عالمية رئيسية جديدة¹. في الوقت الحاضر ، يتم تصنيف الأدوية المضادة للتخثر إلى ثلاث مجموعات: الأدوية المضادة لتراكم الصفائح الدموية ، ومضادات التخثر ، وأدوية التخثر. من بينها ، الأدوية الخثارية ، مثل urokinase (المملكة المتحدة) ، منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) ، وما إلى ذلك ، هي الأدوية الوحيدة المستخدمة سريريا التي يمكنها تحلل الجلطة². وفي الوقت نفسه ، يتم تطوير أدوية أكثر أمانا وفعالية للتخثر من خلال تحديد عوامل التخثر الجديدة³.

ومع ذلك ، فإن تح....

Protocol

1. تحضير متجانسة دودة الفول السوداني

1. أضف 50 جم من ديدان الفول السوداني و 150 مل من المحلول الملحي في الخالط.
2. تجانس عند 24000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.
   ملاحظة: كرر 3 مرات.
3. جهاز الطرد المركزي المجانس عند 9710 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. جمع الطافية كما تجانس دودة الفول السوداني لمزيد من الدراسة.

2. إعداد هلام الفيبرينوجين بيج

1. وزن 0.01 g من الفيبرينوجين في كأس زجاجية سعة 50 mL.
2. أضف 1.9 مل من DDH₂O ، 1.3 مل من Tris-HCl (1.5 M ، درجة الحموضة 8.8) ، و 0.05 مل من SDS (10٪ ، w / ....

النتائج

بعد الكهربائي ، تم عرض جميع نطاقات العلامة بوضوح. أظهرت ممرات التحميل 1x SDS-PAGE نطاقات 10 كيلو دالتون فقط (بروموفينول أزرق). لم تظهر عينات sFE ودودة الفول السوداني أي نطاقات يمكن ملاحظتها (الشكل 1). على الرغم من أن نطاقات العينات غير مرئية ، إلا أن أداء العلامة وا.......

Discussion

sFE هو إنزيم فيبرينو (جينو) لاتيك جديد معزول من ديدان الفول السوداني من قبل فريقنا سابقا^3،6،8،13. ومع ذلك ، كانت عمليات تحديد sFE تستغرق وقتا وعمالة ، بما في ذلك اكتشاف نشاط تحلل الفيبرين ، وفصل مكونات البرو.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200