הפרדה מהירה והצגה של חומרים פיברינוגנוליטיים פעילים ב- Sipunculus nudus באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.

Abstract

חומרים פיברינוגנוליטיים שיכולים להמיס פיברינוגן ישירות נמצאים בשימוש נרחב בטיפול נוגד קרישה. באופן כללי, זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים חדשים דורש תחילה הפרדה של כל רכיב ולאחר מכן בדיקת הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. נכון לעכשיו, אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) וכרומטוגרפיה משמשים בעיקר בשלב ההפרדה. בינתיים, בדיקת צלחת פיברינוגן ומוצרי תגובה מבוססי PAGE מאומצים בדרך כלל כדי להציג את הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. עם זאת, בגלל ההפרדה המרחבית-זמנית של שני שלבים אלה, אי אפשר להפריד ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים הפעילים עם אותו ג'ל. כדי לפשט את תהליכי ההפרדה וההצגה של זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים, בנינו שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של תולעי בוטנים (Sipunculus nudus) במחקר זה. שיטה זו כוללת הכנת פיברינוגן-PAGE, אלקטרופורזה, רנטורה, דגירה, צביעה ודה-קולוריזציה. הפעילות הפיברינוגנוליטית והמשקל המולקולרי של החלבון יכולים להיות מזוהים בו זמנית. על פי שיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של תולעת בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.

Introduction

בשנים האחרונות, בשל העלייה המתמשכת של מחלות טרומבוטיות, מחלות טרומבוטיות הפכו לבעיה בריאותית עולמית גדולה חדשה¹. כיום, תרופות antithrombotic מסווגים לשלוש קבוצות: תרופות צבירה טסיות, נוגדי קרישה, ותרופות thrombolytic. ביניהם, תרופות thrombolytic, כגון urokinase (בריטניה), רקמות plasminogen activator (tPA), וכו ', הם התרופות היחידות בשימוש קליני שיכול hydrolyze פקקת². בינתיים, תרופות תרומבוליטיות בטוחות ויעילות יותר מפותחות על ידי זיהוי של סוכנים טרומבוליטיים חדשים³.

עם זאת, הזיהוי של חומרים טרומבוליטיים חדשים הוא גוזל זמן ודורש עבודה, הכוללת בעיקר את שלבי ההפרדה/טיהור ואפיון/בדיקה. הראשון הוא להפריד כל רכיב, והשני הוא להציג את הפעילות הפיברינו(גנו) הליטית שלהם ^4,5. במחקרים קודמים, למרות העובדה שבודדנו בהצלחה אנזים פיברינו (גנו) ליטי (sFE) מתולעת בוטנים (Sipunculus nudus) על ידי כרומטוגרפיית זיקה ובדיקת צלחת פיברין (עוגן) ^6,7,8, תהליכים אלה גוזלים זמן ועבודה. ראשית, יש לקבוע אם לתולעי בוטנים יש פעילות פיברינו (גנו) ליטי על ידי שיטת צלחת פיברין (עוגן) ותוצרי תגובה בהתבסס על עמוד⁹. לאחר מכן, סדרה של כרומטוגרפיה, כגון כרומטוגרפיית חילופי יונים, כרומטוגרפיית סינון ג'ל, כרומטוגרפיית זיקה ושיטות אחרות, צריכה להתבצע לצורך הפרדה וטיהור^10,11. לאחר מכן, בדיקת צלחת פיברין מבוצעת שוב כדי לבדוק את הפעילות הפיברינוגנוליטית של כל רכיב מופרד. לבסוף, native-PAGE ונתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE מבוצעים כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של סוכנים פיברינוגנוליטיים פעילים¹². לכן, זה קריטי להפריד במהירות ולהציג את החומרים fibrinogenolytic פעיל.

כדי להפריד ולהציג במהירות את החומרים הפיברינוגנוליטיים הפעילים בהומוגנאטים של תולעי בוטנים, פותחה שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה על ידי שילוב שיטות לוחות PAGE ופיברינוגן, כלומר, הסובסטרטים של חומרים פיברינוגנוליטיים פיברינוגן נוספו לג'ל הילידים-PAGE. לאחר native-PAGE, הרכיבים הופרדו על ידי משקלם המולקולרי. בינתיים, כל רכיב פיברינוגנוליטי פעיל יכול להיות מוצג על ידי צביעה. בשיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של הומוגנט תולעי בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.

Protocol

1. הכנת תולעי בוטנים הומוגנט

1. הוסף 50 גרם של תולעי בוטנים ו 150 מ"ל של תמיסת מלח לתוך homogenizer.
2. הומוגניזציה ב 24000 סל"ד במשך 60 שניות.
   הערה: חזור על הפעולה 3 פעמים.
3. צנטריפוגה הומוגנאט ב 9710 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F).
4. אספו את הסופרנאטנט כתולעת בוטנים הומוגנית למחקר נוסף.

2. הכנת ג'ל פיברינוגן-PAGE

1. שוקלים 0.01 גרם פיברינוגן לתוך זכוכית 50 מ"ל.
2. הוסף 1.9 מ"ל של DDH₂O, 1.3 מ"ל של Tris-HCl (1.5 M, pH 8.8) ו- 0.05 מ"ל של SDS (10%, w/v) לתוך הכד; מערבבים היטב על ידי pipetting.
3. מניחים את הכד על 37°C למשך 30 דקות.
   הערה: שלב זה הוא להמיס את הפיברינוגן.
4. הוסף 1.7 מ"ל של אקרילאמיד (30%, w / v), 0.05 מ"ל של אמוניום פרסולפט (APS; 10%, w / v), 0.002 מ"ל של TEMED; מערבבים היטב על ידי pipetting.
   הערה: זהו ג'ל הפרדה.
5. יוצקים את ג'ל ההפרדה לתוך תבנית ג'ל 10 בארות.
6. הוסף 2 מ"ל של DDH₂O לתוך תבנית ג'ל; המתן 30 דקות.
7. מוציאים את המים ביסודיות על ידי הפיכת התבנית.
8. הוסף 1.4 מ"ל של DDH₂O, 0.25 מ"ל של Tris-HCl (1.0 M, pH 6.8), 0.02 מ"ל של SDS (10%, w / v), 0.33 מ"ל של אקרילאמיד (30%, w / v), 0.02 מ"ל של APS (10%, w / v), 0.002 מ"ל של tetramethylethylenediamine (TEMED) לתוך הכד; מערבבים היטב על ידי pipetting.
   הערה: זהו ג'ל טעינה.
9. יוצקים את ג'ל ההעמסה לאותה תבנית ג'ל כמו שלב 2.5; הכנס את המסרק מיד.
   הערה: ג'ל הפיברינוגן-PAGE המשמש כאן הורכב מהפיברינוגן (0.2%) המכיל ג'ל הפרדה וג'ל העמסה. ניתן לכוונן את ריכוז הפיברינוגן לפי הצורך.

3. אלקטרופורזה

1. מניחים את ג'ל הפיברינוגן-PAGE המוכן יחד עם תבנית הדבק למיכל האלקטרופורזה; לשפוך 1300 מ"ל של תמיסת אלקטרופורזה (1.963 גרם של טריס, 12.22 גרם של גליצין, 0.65 גרם של SDS, ו 1300 מ"ל של DDH₂O) לתוך המיכל; מוציאים את המסרק.
2. הוסף 5 μL של 5x מאגר העמסה non-denaturing ל 20 μL של sFE ו 20 μL של הומוגנט תולעי בוטנים; מערבבים היטב על ידי pipetting; טען אותם לתוך ג'ל פיברינוגן-PAGE מוכן.
   הערה: אין להרתיח את התערובת. sFE הוא אנזים פיברינו (גנו) ליטי שזוהה בעבר ^6,7,8 ומשמש כבקרה חיובית במחקר זה. הומוגנאט תולעי בוטנים הוא הדגימה שיש לזהות. מאגר העמסה ללא דנטורציה ללא ברומופנול כחול, β-מרקפטואתנול ו-SDS בהשוואה למאגר הטעינה SDS-PAGE. כל נתיב דגימה מופרד באמצעות מאגר טעינה 1x SDS-PAGE כדי לזהות בבירור את תנועת החלבון.
3. בצע אלקטרופורזה במתח של 80 וולט למשך 30 דקות, או 120 וולט למשך 20 דקות.
4. מוציאים את ג'ל הפיברינוגן-PAGE מתבנית הדבק.

4. רנטורציה

1. מעבירים את ג'ל הפיברינוגן-PAGE לקופסת פלסטיק.
2. הוסף 100 מ"ל של Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) ו- 2 מ"ל של Triton X-100 לתוך הקופסה. הניחו אותו על שייקר במהירות 60-70 סל"ד למשך 10 דקות.
3. הסירו את חיץ הכביסה על ידי פיפט.
   הערה: חזור על הפעולה שלוש פעמים.

5. אינקובציה

1. הוסף 50 מ"ל של Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) לתוך קופסת הפלסטיק.
2. לדגור ב 37 ° C במשך 4 שעות.
   הערה: ניתן לכוונן את זמן הדגירה בהתאם לעוצמת הפעילות הפיברינוגנוליטית.

6. צביעה

1. הסר את מאגר הדגירה על ידי פיפטציה.
2. מוסיפים 50 מ"ל של תמיסת צביעה כחולה מבריקה של קומאסי לקופסה ומניחים את הקופסה על שייקר במהירות 60-70 סל"ד למשך 30 דקות.

7. דה-קולוריזציה

1. הסר את תמיסת הצביעה על ידי פיפט.
2. הוסף 50 מ"ל של DDH₂O לקופסה.
3. מניחים את הקופסה על שייקר במהירות 60-70 סל"ד למשך 30 דקות.
   הערה: DD H₂O שימש כפתרון העיכוב כאן. ניתן לכוונן את זמן הרעידה בהתאם לעוצמת הפעילות הפיברינוגנוליטית.

תוצאות

לאחר אלקטרופורזה, כל הפסים של הסמן הוצגו בבירור. נתיבי הטעינה 1x SDS-PAGE הראו רק 10 רצועות kDa (ברומופנול כחול). דגימות sFE ותולעי בוטנים לא הראו פסים נצפים (איור 1). למרות שהרצועות של הדגימות אינן נראות לעין, הביצועים של הסמן והברומופנול הכחול הצביעו על כך שהאלקטרו...

Discussion

sFE הוא אנזים פיברינו (גנו) ליטי חדשני שבודד מתולעי בוטנים על ידי הצוות שלנו בעבר 3,6,8,13. עם זאת, תהליכי הזיהוי של sFE היו גוזלים זמן ועבודה, וכללו זיהוי פעילות פיברינוגנוליטית, הפרדת רכיבי חלבונים ושלבי אי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200