Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi

Özet

Burada, Sipunculus nudus'un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.

Özet

Fibrinojeni doğrudan çözebilen fibrinojenolitik ajanlar, anti-koagülasyon tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, yeni fibrinogenolitik ajanların tanımlanması, önce her bir bileşenin ayrılmasını ve ardından fibrinogenolitik aktivitelerinin kontrol edilmesini gerektirir. Şu anda, ayırma aşamasında çoğunlukla poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve kromatografi kullanılmaktadır. Bu arada, fibrinojen plaka tahlili ve PAGE bazlı reaksiyon ürünleri genellikle fibrinojenolitik aktivitelerini göstermek için benimsenir. Bununla birlikte, bu iki aşamanın uzay-zamansal ayrımı nedeniyle, aktif fibrinojenolitik ajanları aynı jel ile ayırmak ve görüntülemek mümkün değildir. Fibrinojenolitik ajan tanımlamasının ayırma ve görüntüleme süreçlerini basitleştirmek için, bu çalışmada yer fıstığı kurtlarının (Sipunculus nudus) fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi oluşturduk. Bu yöntem, fibrinojen-PAGE hazırlama, elektroforez, renatürasyon, inkübasyon, boyama ve renk gidermeyi içerir. Proteinin fibrinojenolitik aktivitesi ve moleküler ağırlığı aynı anda tespit edilebilir. Bu yönteme göre, fıstık kurduhomojenatın birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Son yıllarda, trombotik hastalıkların devam eden artışı nedeniyle, trombotik hastalıklar yeni ve önemli bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir¹. Şu anda, antitrombotik ilaçlar üç gruba ayrılır: anti-trombosit agregasyon ilaçları, antikoagülanlar ve trombolitik ilaçlar. Bunlar arasında, ürokinaz (İngiltere), doku plazminojen aktivatörü (tPA), vb. gibi trombolitik ilaçlar, trombüs^2'yi hidrolize edebilen klinik olarak kullanılan tek ilaçlardır. Bu arada, yeni trombolitik ajanların tanımlanması ile daha güvenli ve etkili trombolitik ilaçlar geliştirilmektedir³.

Protokol

1. Fıstık kurdu homojenat hazırlama

1. Homojenizatöre 50 g fıstık kurdu ve 150 mL tuzlu su çözeltisi ekleyin.
2. 24000 rpm'de 60 sn boyunca homojenize edin.
   NOT: 3 kez tekrarlayın.
3. Homojenatı 9710 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
4. Daha fazla çalışma için süpernatanı fıstık kurdu homojenatı olarak toplayın.

2. Fibrinojen-PAGE jel hazırlama

1. 0.01 g fibrinojeni 50 mL'lik bir cam behere tartın.
2. Behere 1.9 mL DDH₂O, 1.3 mL Tris-HCl (1.5 M, pH 8.8) ve 0.05 mL SDS (% 10, a / h) ekleyin; Pipetl....

Tartışmalar

sFE, ekibimiz tarafından daha önce ^3,6,8,13 yılında yer fıstığı kurtlarından izole edilen yeni bir fibrino (geno) litik enzimdir. Bununla birlikte, sFE'nin tanımlama süreçleri, fibrinojenolitik aktivite tespiti, protein bileşenlerinin ayrılması ve aktivite doğrulama aşamalarını içeren zaman ve emek alıcıydı. Basit bir yöntem olarak, fibr.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200