Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi

Özet

Burada, Sipunculus nudus'un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.

Özet

Fibrinojeni doğrudan çözebilen fibrinojenolitik ajanlar, anti-koagülasyon tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, yeni fibrinogenolitik ajanların tanımlanması, önce her bir bileşenin ayrılmasını ve ardından fibrinogenolitik aktivitelerinin kontrol edilmesini gerektirir. Şu anda, ayırma aşamasında çoğunlukla poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve kromatografi kullanılmaktadır. Bu arada, fibrinojen plaka tahlili ve PAGE bazlı reaksiyon ürünleri genellikle fibrinojenolitik aktivitelerini göstermek için benimsenir. Bununla birlikte, bu iki aşamanın uzay-zamansal ayrımı nedeniyle, aktif fibrinojenolitik ajanları aynı jel ile ayırmak ve görüntülemek mümkün değildir. Fibrinojenolitik ajan tanımlamasının ayırma ve görüntüleme süreçlerini basitleştirmek için, bu çalışmada yer fıstığı kurtlarının (Sipunculus nudus) fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi oluşturduk. Bu yöntem, fibrinojen-PAGE hazırlama, elektroforez, renatürasyon, inkübasyon, boyama ve renk gidermeyi içerir. Proteinin fibrinojenolitik aktivitesi ve moleküler ağırlığı aynı anda tespit edilebilir. Bu yönteme göre, fıstık kurduhomojenatın birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Son yıllarda, trombotik hastalıkların devam eden artışı nedeniyle, trombotik hastalıklar yeni ve önemli bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir¹. Şu anda, antitrombotik ilaçlar üç gruba ayrılır: anti-trombosit agregasyon ilaçları, antikoagülanlar ve trombolitik ilaçlar. Bunlar arasında, ürokinaz (İngiltere), doku plazminojen aktivatörü (tPA), vb. gibi trombolitik ilaçlar, trombüs^2'yi hidrolize edebilen klinik olarak kullanılan tek ilaçlardır. Bu arada, yeni trombolitik ajanların tanımlanması ile daha güvenli ve etkili trombolitik ilaçlar geliştirilmektedir³.

Bununla birlikte, yeni trombolitik ajanların tanımlanması zaman alıcı ve emek yoğundur, bu da esas olarak ayırma/saflaştırma ve karakterizasyon/kontrol aşamalarını içerir. Birincisi, her bir bileşeni ayırmak ve ikincisi, fibrino (geno) litik aktivitelerini göstermektir ^4,5. Önceki çalışmalarda, fıstık kurdundan (Sipunculus nudus) afinite kromatografisi ve fibrin (ojen) plaka testi ^6,7,8 ile yeni bir fibrino (geno) litik enzimi (sFE) başarılı bir şekilde izole etmiş olmamıza rağmen, bu işlemler çok zaman ve emek alıcıdır. İlk olarak, fıstık kurdu homojenatlarının fibrino(geno)litik aktiviteye sahip olup olmadığının fibrin(ojen) plaka yöntemi ve SAYFA^9'a dayalı reaksiyon ürünleri ile belirlenmesi gerekmektedir. Daha sonra, ayırma ve saflaştırma için iyon değişim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi, afinite kromatografisi ve diğer yöntemler gibi bir dizi kromatografi gerçekleştirilmelidir^10,11. Daha sonra, ayrılan her bir bileşenin fibrinojenolitik aktivitesini kontrol etmek için fibrin plaka testi tekrar gerçekleştirilir. Son olarak, aktif fibrinojenolitik ajanların¹² moleküler ağırlığını belirlemek için doğal PAGE ve sodyum dodesil sülfat (SDS)-PAGE gerçekleştirilir. Bu nedenle, aktif fibrinojenolitik ajanların hızlı bir şekilde ayrılması ve görüntülenmesi kritik öneme sahiptir.

Yer fıstığı kurdu homojenatlarındaki aktif fibrinojenolitik ajanları hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için, PAGE ve fibrinojen plaka yöntemlerinin birleştirilmesiyle yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi geliştirilmiştir, yani fibrinojen ajanlarının substratları fibrinojen doğal PAGE jeline eklenmiştir. Native-PAGE'den sonra, bileşenler moleküler ağırlıklarına göre ayrıldı. Bu arada, her aktif fibrinojenolitik bileşen boyama ile görüntülenebilir. Bu yöntemle, fıstık kurdu homojenatının birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.

Protokol

1. Fıstık kurdu homojenat hazırlama

1. Homojenizatöre 50 g fıstık kurdu ve 150 mL tuzlu su çözeltisi ekleyin.
2. 24000 rpm'de 60 sn boyunca homojenize edin.
   NOT: 3 kez tekrarlayın.
3. Homojenatı 9710 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
4. Daha fazla çalışma için süpernatanı fıstık kurdu homojenatı olarak toplayın.

2. Fibrinojen-PAGE jel hazırlama

1. 0.01 g fibrinojeni 50 mL'lik bir cam behere tartın.
2. Behere 1.9 mL DDH₂O, 1.3 mL Tris-HCl (1.5 M, pH 8.8) ve 0.05 mL SDS (% 10, a / h) ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
3. Beheri 37 °C'de 30 dakika bekletin.
   NOT: Bu adım fibrinojeni çözmek içindir.
4. 1.7 mL akrilamid (% 30, a / h), 0.05 mL amonyum persülfat (APS;% 10, a / h), 0.002 mL TEMED ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
   NOT: Bu ayırma jelidir.
5. Ayırma jelini 10 oyuklu bir jel kalıba dökün.
6. Jel kalıba 2 mL DDH₂O ekleyin; 30 dakika bekleyin.
7. Kalıbı ters çevirerek suyu iyice çıkarın.
8. 1.4 mL DDH₂O, 0.25 mL Tris-HCl (1.0 M, pH 6.8), 0.02 mL SDS (% 10, w / v), 0.33 mL akrilamid (% 30, w / v), 0.02 mL APS (% 10, w / v), 0.002 mL tetrametiletilendiamin (TEMED) behere ekleyin; Pipetleme ile iyice karıştırın.
   NOT: Bu jel yükleniyor.
9. Yükleme jelini adım 2.5 ile aynı jel kalıba dökün; Tarağı hemen yerleştirin.
   NOT: Burada kullanılan fibrinojen-PAGE jeli, ayırıcı jel ve yükleme jeli içeren fibrinojen (%0.2) den oluşmuştur. Fibrinojen konsantrasyonu gerektiği gibi ayarlanabilir.

3. Elektroforez

1. Hazırlanan fibrinojen-PAGE jelini tutkal kalıbı ile birlikte elektroforez tankına yerleştirin; tanka 1300 mL elektroforez çözeltisi (1.963 g Tris, 12.22 g glisin, 0.65 g SDS ve 1300 mL DDH₂O) dökün; tarağı çıkarın.
2. 20 μL sFE ve 20 μL fıstık kurdu homojenatına 5 μL 5x denatüre olmayan yükleme tamponu ekleyin; pipetleyerek iyice karıştırın; bunları hazırlanan fibrinojen-PAGE jeli içine yükleyin.
   NOT: Karışımı kaynatmayın. sFE, daha önce ^6,7,8 olarak tanımlanan bir fibrino(geno)litik enzimdir ve bu çalışmada pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Fıstık kurdu homojenatı tespit edilecek numunedir. SDS-PAGE yükleme tamponu ile karşılaştırıldığında bromofenol mavisi, β-merkaptoetanol ve SDS içermeyen denatüre olmayan yükleme tamponu. Her numune şeridi, proteinin hareketini net bir şekilde tespit etmek için 1x SDS-PAGE yükleme tamponu ile ayrılır.
3. 30 dakika boyunca 80 V'ta veya 20 dakika boyunca 120 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
4. Fibrinojen-PAGE jeli tutkal kalıbından çıkarın.

4. Yeniden doğuş

1. Fibrinojen-PAGE jeli plastik bir kutuya aktarın.
2. Kutuya 100 mL Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) ve 2 mL Triton X-100 ekleyin. 10 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
3. Pipetleme ile yıkama tamponunu çıkarın.
   NOT: Üç kez tekrarlayın.

5. Kuluçka

1. Plastik kutuya 50 mL Tris-HCl (0.05 M, pH 7.4) ekleyin.
2. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
   NOT: Kuluçka süresi fibrinojenolitik aktivitenin gücüne göre ayarlanabilir.

6. Boyama

1. Pipetleme ile inkübasyon tamponunu çıkarın.
2. Kutuya 50 mL Coomassie Brillant Blue Staining solüsyonu ekleyin ve kutuyu 30 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

7. Renk giderme

1. Pipetleme solüsyonunu pipetleyerek çıkarın.
2. Kutuya 50 mL DDH₂O ekleyin.
3. Kutuyu 30 dakika boyunca 60-70 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
   NOT: Burada leke giderme solüsyonu olarak DD H₂O kullanılmıştır. Çalkalama süresi, fibrinojenolitik aktivitenin gücüne göre ayarlanabilir.

Sonuçlar

Elektroforezden sonra, işaretleyicinin tüm bantları net bir şekilde gösterildi. 1x SDS-PAGE yükleme şeritleri yalnızca 10 kDa bantları (bromofenol mavisi) gösterdi. SFE ve fıstık kurdu örnekleri herhangi bir gözlemlenebilir bant göstermedi (Şekil 1). Numunelerin bantları görünmese de, markör ve bromofenol mavisinin performansı elektroforezin başarılı olduğunu gösterdi ve numuneler moleküler ağırlıklarına göre ayrıldı.

Tartışmalar

sFE, ekibimiz tarafından daha önce ^3,6,8,13 yılında yer fıstığı kurtlarından izole edilen yeni bir fibrino (geno) litik enzimdir. Bununla birlikte, sFE'nin tanımlama süreçleri, fibrinojenolitik aktivite tespiti, protein bileşenlerinin ayrılması ve aktivite doğrulama aşamalarını içeren zaman ve emek alıcıydı. Basit bir yöntem olarak, fibr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200