Schnelle Trennung und Darstellung von aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffen in Sipunculus nudus durch Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Protokoll (PAGE) vor, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Sipunculus nudus schnell zu trennen und darzustellen.

Zusammenfassung

Fibrinogenolytika, die Fibrinogen direkt auflösen können, werden häufig in der Antikoagulationsbehandlung eingesetzt. Im Allgemeinen erfordert die Identifizierung neuer fibrinogenolytischer Wirkstoffe zunächst die Trennung der einzelnen Komponenten und dann die Überprüfung ihrer fibrinogenolytischen Aktivitäten. Derzeit werden die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Chromatographie hauptsächlich in der Trennphase eingesetzt. In der Zwischenzeit werden in der Regel die auf PAGE basierenden Fibrinogenplattenassays und Reaktionsprodukte verwendet, um ihre fibrinogenolytischen Aktivitäten anzuzeigen. Wegen der räumlich-zeitlichen Trennung dieser beiden Stadien ist es jedoch unmöglich, die fibrinogenolytischen Wirkstoffe mit ein und demselben Gel zu trennen und auszustellen. Um die Trennungs- und Darstellungsprozesse der Fibrinogenolytika-Identifizierung zu vereinfachen, haben wir in dieser Studie eine neue Fibrinogen-PAGE-Methode entwickelt, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Erdnusswürmern (Sipunculus nudus) schnell zu trennen und darzustellen. Diese Methode umfasst die Fibrinogen-PAGE-Vorbereitung, Elektrophorese, Renaturierung, Inkubation, Färbung und Entfärbung. Die fibrinogenolytische Aktivität und das Molekulargewicht des Proteins können gleichzeitig nachgewiesen werden. Nach dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff des Erdnusswurmhomogenats nachweisen. Darüber hinaus ist diese Fibrinogen-PAGE-Methode zeit- und kostensparend. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe der anderen Organismen zu untersuchen.

Einleitung

In den letzten Jahren sind thrombotische Erkrankungen aufgrund des anhaltenden Anstiegs thrombotischer Erkrankungen zu einem neuen großen globalen Gesundheitsproblem geworden¹. Gegenwärtig werden Antithrombotika in drei Gruppen eingeteilt: Thrombozytenaggregationshemmer, Antikoagulanzien und Thrombolytika. Unter ihnen sind thrombolytische Medikamente wie Urokinase (UK), Gewebeplasminogenaktivator (tPA) usw. die einzigen klinisch verwendeten Medikamente, die den Thrombus² hydrolysieren können. In der Zwischenzeit werden durch die Identifizierung neuartiger Thrombolytika sicherere und wirk....

Protokoll

1. Zubereitung des Erdnusswurm-Homogenats

1. Geben Sie 50 g Erdnusswürmer und 150 ml Kochsalzlösung in den Homogenisator.
2. Homogenisieren Sie bei 24000 U/min für 60 s.
   HINWEIS: 3 Mal wiederholen.
3. Das Homogenat wird bei 9710 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
4. Sammeln Sie den Überstand als Erdnusswurm-Homogenat für weitere Studien.

2. Fibrinogen-PAGE Gel-Vorbereitung

1. Wiegen Sie 0,01 g Fibrinogen in ein 50-ml-Glasbecherglas.
2. 1,9 mL DDH₂O, 1,3 mL Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) und 0,05 mL SDS (10....

Diskussion

sFE ist ein neuartiges fibrino(geno)lytisches Enzym, das von unserem Team zuvor aus Erdnusswürmern isoliert wurde 3,6,8,13. Die Identifizierungsprozesse von sFE waren jedoch zeit- und arbeitsaufwendig und umfassten den Nachweis der fibrinogenolytischen Aktivität, die Trennung der Proteinkomponenten und die Aktivitätsbestätigungsphasen. Als einfache Methode .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200