A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
تم استخدام نموذج تجريبي لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) في الفئران للتحقيق في دور خلايا CD4 T في الانتكاس الأولي والانتكاسة ل EAE من منظور مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي.
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الخلايا المناعية وإزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يعمل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) كنموذج حيواني نموذجي لدراسة مرض التصلب العصبي المتعدد. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى التحقيق في دور خلايا CD4 T في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والاستجابة المناعية. لإنشاء نموذج الفئران EAE ، تم تحصين إناث الفئران ببروتين سكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 مستحلب بمساعد فرويند الكامل (CFA). تم تقييم الدرجات السريرية يوميا ، وأظهرت النتائج أن الفئران في مجموعة EAE أظهرت نمطا كلاسيكيا للانتكاس. كشف تحليل تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) واللوكسول الأزرق السريع (LFB) عن تسلل كبير للخلايا الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي وإزالة الميالين في الفئران EAE. فيما يتعلق بمرحلة التنشيط ، قد تساهم كل من خلايا المستجيب CD4 + CD69 + T (Teff) وخلايا CD4 + CD44 + CD62L في بدء EAE ، ومع ذلك ، ربما كانت مرحلة الانتكاس تهيمن عليها خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem. بالإضافة إلى ذلك ، من حيث وظيفة المناعة ، تشارك الخلايا التائية (Th) 1 المساعدة بشكل أساسي في بدء EAE. ومع ذلك ، تساهم كل من خلايا Th1 و Th17 في مرحلة الانتكاس ، وتم تثبيط الوظيفة المثبطة للمناعة للخلايا التائية التنظيمية (Treg) أثناء العملية المرضية EAE.
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع الخلايا المناعية وإزالة الميالين1،2. أظهرت دراسة حديثة أنه أكثر أمراض الإعاقة شيوعا التي تصيب الشباب ، مع زيادة معدل حدوثه باستمرار في جميع أنحاءالعالم 3. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني نموذجي لمرض التصلب العصبي المتعدد يحاكي العديد من جوانب المرحلة الالتهابية لمرض التصلب العصبي المتعددالبشري 4. من منظور الوظائف المناعية ، يشار إلى خلايا CD4 T الأولية التي لم تصادف المستضدات بعد باسم الخلايا T (Th) 0 المساعدة. تخضع هذه الخلايا لعمليات النضج والتنشيط لإظهار وظائف مختلفة. يمكن تصنيف خلايا CD4 T إلى عدة مجموعات فرعية وفقا لوظائفها المحددة ، والتي تشمل خلايا Th1 و Th2 و T التنظيمية (Treg) و مساعد البصيلات T (Tfh) و Th17 و Th9 و Th225. من الإجماع الشائع أن الأنواع الفرعية للخلايا Th1 و Th17 هي عوامل التسبب في المرض الحاسمة ل EAE6. يمكن أن تفرز خلايا Th1 γ الإنترفيرون (IFN-γ) ، وتفرز خلايا Th17 الإنترلوكين (IL) -17 وعوامل التهابية أخرى ، والتي يمكن أن تنشط الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا الدبقية الدقيقة والخلايا النجمية. تنتج هذه الخلايا السيتوكينات الالتهابية7 ، مثل IL-18 و IL-12 و IL-23 و IL-1β ، والتي يمكن أن تحفز الاستجابة المناعية لخلايا Th1 / Th17 ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين التدريجي والتلف المحوري. من منظور مرحلة التنشيط ، تمتلك خلايا CD4 T مصيرا محددا مسبقا لتتطور إلى مجموعات فرعية مميزة للخلايا وحالات متمايزة ، بما في ذلك الخلايا التائية الساذجة والمستجيب والذاكرة8. تتكاثر خلايا CD4 T الأولية وتتمايز إلى مجموعة متنوعة من مجموعات فرعية من المستجيب بوظائف مختلفة في بيئاتمختلفة 9. معظم الخلايا المستجيبة قصيرة العمر ، حيث تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا التائية إلى خلايا ذاكرة تائية تظهر وظائف مستجيب سريعة عند مواجهة نفس المستضدات مرة أخرى وتزود المضيف بحماية قوية للغاية وطويلة الأمد10،11.
على الرغم من أن الأبحاث الحالية تشير إلى أن خلايا CD4 T تلعب دورا مهما في تطور EAE ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح كيف تساهم مجموعات الخلايا التائية المختلفة CD4 ، المصنفة بناء على مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي ، في بدء وانتكاس EAE. في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج EAE في الفئران C57BL6 / J عن طريق تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 وحققنا في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والوظيفة المناعية لخلايا CD4 T.
تم تقسيم ما مجموعه 18 فأرة من أنثى C57BL / 6J تتراوح أعمارهم بين ستة إلى ثمانية أسابيع بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم (ن = 6) ومجموعة EAE (ن = 12) لهذه الدراسة. تم شراء الفئران من مركز التجربة بجامعة نينغشيا الطبية. تم إيواء الفئران في غرفة يتم التحكم فيها في درجة الحرارة والرطوبة مع دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة ، وحرية الوصول إلى المياه العذبة والغذاء. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة أخلاقيات التجريبية بجامعة نينغشيا الطبية قبل بدء الدراسة.
1. تطوير EAE الانتكاسي في الفئران C57BL / 6
2. تحليل التلوين النسيجي
3. تحليل تلطيخ LFB
4. تحليل قياس التدفق الخلوي
5. تحليل السيتوكينات بواسطة مصفوفة حبة القياس الخلوي
تقييم الدرجات السريرية
كما هو موضح في الشكل 1 ، لم تظهر على الفئران في المجموعة الضابطة أي أعراض سريرية. أظهرت الفئران في مجموعة EAE ، التي تم تحصينها ب MOG35-55 ، شلل الذيل بعد حوالي 12 يوما من التحصين. بحلول اليوم 16 ، وصلت الأعراض إلى شلل كامل في الأطر...
مرض التصلب العصبي المتعدد هو أكثر أمراض إزالة الميالين المناعي الذاتي انتشارا في الجهاز العصبي المركزي ، والذي يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاءالعالم 17. EAE هو النموذج الحيواني النموذجي لمحاكاة السمات المرضية السريرية ل MS18. أظهرت الدراسات أن ا...
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في نينغشيا (2022AAC03601 و 2023AAC02087) ومؤسسة الأبحاث بجامعة نينغشيا الطبية (XM2019052). شكرا لدعم مركز أبحاث العلوم والتكنولوجيا الطبية بجامعة نينغشيا الطبية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia machine evaporator | Norvap | 20-17368 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 792632 | |
70 μm cell strainer | XIYAN Co.,Ltd. | 15-1070 | |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103128 | |
APC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100616 | |
Automatic cell counter | Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD | JIMBIO iCyta S2 | |
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit | BD Biosciences | 560485 | |
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101303 | |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody | Biolegend | 104532 | |
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14) | BD Pharmingen | 563109 | |
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd | PC201Plus | |
Complete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLCH4887 | |
Dehydrator | DIAPATH | Donatello | |
Disposable sterilized syringe (1 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (2.5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Dyeing machine | DIAPATH | Giotto | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Ethanol | SCRC | 100092683 | |
Fetal Bovine Serum | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | FSP500 | |
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11) | BD Pharmingen | 553062 | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCelesta | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | Accuri C6 | |
Flow Jo software | BD Biosciences | 10.8.1 | |
Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Glass slide | Servicebio | G6004 | |
HE dye solution set | Servicebio | G1003 | |
Hematoxylin-Eosin solution | Servicebio | G1002 | |
High speed refrigerated centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Mogafugo8R | |
Imaging system | Nikon | NIKON DS-U3 | |
Luxol fast blue staining kit | Servicebio | G1030 | |
Ms CD44 BV421 IM7 | BD Pharmingen | 564970 | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | BD Pharmingen | 231141 | |
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) | AnaSpec | AS-60130-1 | |
Neutral gum | SCRC | 10004160 | |
Organizer | KEDEE | KD-P | |
Oven | Labotery | GFL-230 | |
Pathology slicer | Leica | RM2016 | |
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | P7208 | |
Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
Pipette 0.5-10 μL | DLAB Scientific | 7010101004 | |
Pipette 100-1000 μL | DLAB Scientific | 7010101014 | |
Pipette 20-200 μL | DLAB Scientific | 7010101009 | |
RPMI-1640 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | PM150110 | |
Tee valve | Guangdong Kanghua Medical Co., LTD | A06 | |
Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd | KD-P | |
Upright optical microscope | Nikon | NIKON ECLIPSE E100 | |
Xylene | SCRC | 10023418 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved