JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم استخدام نموذج تجريبي لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) في الفئران للتحقيق في دور خلايا CD4 T في الانتكاس الأولي والانتكاسة ل EAE من منظور مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي.

Abstract

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الخلايا المناعية وإزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يعمل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) كنموذج حيواني نموذجي لدراسة مرض التصلب العصبي المتعدد. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى التحقيق في دور خلايا CD4 T في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والاستجابة المناعية. لإنشاء نموذج الفئران EAE ، تم تحصين إناث الفئران ببروتين سكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 مستحلب بمساعد فرويند الكامل (CFA). تم تقييم الدرجات السريرية يوميا ، وأظهرت النتائج أن الفئران في مجموعة EAE أظهرت نمطا كلاسيكيا للانتكاس. كشف تحليل تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) واللوكسول الأزرق السريع (LFB) عن تسلل كبير للخلايا الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي وإزالة الميالين في الفئران EAE. فيما يتعلق بمرحلة التنشيط ، قد تساهم كل من خلايا المستجيب CD4 + CD69 + T (Teff) وخلايا CD4 + CD44 + CD62L في بدء EAE ، ومع ذلك ، ربما كانت مرحلة الانتكاس تهيمن عليها خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem. بالإضافة إلى ذلك ، من حيث وظيفة المناعة ، تشارك الخلايا التائية (Th) 1 المساعدة بشكل أساسي في بدء EAE. ومع ذلك ، تساهم كل من خلايا Th1 و Th17 في مرحلة الانتكاس ، وتم تثبيط الوظيفة المثبطة للمناعة للخلايا التائية التنظيمية (Treg) أثناء العملية المرضية EAE.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع الخلايا المناعية وإزالة الميالين1،2. أظهرت دراسة حديثة أنه أكثر أمراض الإعاقة شيوعا التي تصيب الشباب ، مع زيادة معدل حدوثه باستمرار في جميع أنحاءالعالم 3. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني نموذجي لمرض التصلب العصبي المتعدد يحاكي العديد من جوانب المرحلة الالتهابية لمرض التصلب العصبي المتعددالبشري 4. من منظور الوظائف المناعية ، يشار إلى خلايا CD4 T الأولية التي لم تصادف المستضدات بعد باسم الخلايا T (Th) 0 المساعدة. تخضع هذه الخلايا لعمليات النضج والتنشيط لإظهار وظائف مختلفة. يمكن تصنيف خلايا CD4 T إلى عدة مجموعات فرعية وفقا لوظائفها المحددة ، والتي تشمل خلايا Th1 و Th2 و T التنظيمية (Treg) و مساعد البصيلات T (Tfh) و Th17 و Th9 و Th225. من الإجماع الشائع أن الأنواع الفرعية للخلايا Th1 و Th17 هي عوامل التسبب في المرض الحاسمة ل EAE6. يمكن أن تفرز خلايا Th1 γ الإنترفيرون (IFN-γ) ، وتفرز خلايا Th17 الإنترلوكين (IL) -17 وعوامل التهابية أخرى ، والتي يمكن أن تنشط الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا الدبقية الدقيقة والخلايا النجمية. تنتج هذه الخلايا السيتوكينات الالتهابية7 ، مثل IL-18 و IL-12 و IL-23 و IL-1β ، والتي يمكن أن تحفز الاستجابة المناعية لخلايا Th1 / Th17 ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين التدريجي والتلف المحوري. من منظور مرحلة التنشيط ، تمتلك خلايا CD4 T مصيرا محددا مسبقا لتتطور إلى مجموعات فرعية مميزة للخلايا وحالات متمايزة ، بما في ذلك الخلايا التائية الساذجة والمستجيب والذاكرة8. تتكاثر خلايا CD4 T الأولية وتتمايز إلى مجموعة متنوعة من مجموعات فرعية من المستجيب بوظائف مختلفة في بيئاتمختلفة 9. معظم الخلايا المستجيبة قصيرة العمر ، حيث تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا التائية إلى خلايا ذاكرة تائية تظهر وظائف مستجيب سريعة عند مواجهة نفس المستضدات مرة أخرى وتزود المضيف بحماية قوية للغاية وطويلة الأمد10،11.

على الرغم من أن الأبحاث الحالية تشير إلى أن خلايا CD4 T تلعب دورا مهما في تطور EAE ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح كيف تساهم مجموعات الخلايا التائية المختلفة CD4 ، المصنفة بناء على مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي ، في بدء وانتكاس EAE. في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج EAE في الفئران C57BL6 / J عن طريق تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 وحققنا في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والوظيفة المناعية لخلايا CD4 T.

Protocol

تم تقسيم ما مجموعه 18 فأرة من أنثى C57BL / 6J تتراوح أعمارهم بين ستة إلى ثمانية أسابيع بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم (ن = 6) ومجموعة EAE (ن = 12) لهذه الدراسة. تم شراء الفئران من مركز التجربة بجامعة نينغشيا الطبية. تم إيواء الفئران في غرفة يتم التحكم فيها في درجة الحرارة والرطوبة مع دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة ، وحرية الوصول إلى المياه العذبة والغذاء. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة أخلاقيات التجريبية بجامعة نينغشيا الطبية قبل بدء الدراسة.

1. تطوير EAE الانتكاسي في الفئران C57BL / 6

  1. إذابة الكاشف
    1. قم بإذابة 5.4 مجم MOG35-55 (جدول المواد) في 1.8 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يزن 12.6 مجم من المتفطرة السلية H37RA (جدول المواد) وأضفه إلى 1.8 مل من محلول Freund المساعد الكامل (CFA) (جدول المواد). قم بإذابة 360 ميكرولتر من سم السعال الديكي (PTX; جدول المواد) إلى 7.2 مل من PBS باستخدام ماصة (جدول المواد).
  2. تحضير مستحلب MOG35-55 و CFA
    1. محلول الماصة MOG35-55 ومحلول CFA باستخدام حقنتين سعة 5 مل محضرتين في الخطوة 1.1 وتوصيلها بصمام نقطة الإنطلاق. تخلط باستمرار على الثلج لمدة 1 ساعة حتى يتم الحصول على مستحلب حليب من الماء في الزيت.
      ملاحظة: يتم تحضير المستحلب بنجاح عندما يطفو على سطح الماء دون تشتت بعد إسقاطه في الماء.
  3. تخدير الفأر
    1. قم بفك غطاء مانع التسرب في الطرف الأمامي لمبخر آلة التخدير. صب ببطء 20 مل من الأيزوفلوران على طول برغي الختم في المنتصف وقفل غطاء ختم التعبئة. قم بتبديل مفتاح صمام الإنطلاق للتأكد من توصيل تدفق الهواء من مبخر آلة التخدير بصندوق تحريض التخدير (جدول المواد).
    2. قم بتوصيل مصدر طاقة مضخة الهواء ، وقم بتشغيل مفتاح مضخة الهواء ، وقم بتدوير وضبط صمام مصدر الهواء في الطرف الأمامي لمقياس تدفق الأكسجين بحيث يكون تدفق الغاز الناتج 400 مل / دقيقة. افتح المبخر ، واضبط تركيز الحث على 3٪ ، وانتظر حتى يملأ المخدر صندوق الحث.
    3. بعد حوالي 1 دقيقة ، ضع الفئران في صندوق الحث ، ثم أغلق صندوق الحث ، وانتظر حتى تكون الفئران في نوم عميق ، واسترخاء العضلات ، وتنفس ثابت ؛ بعد ذلك ، يمكن تحديد الفئران على أنها الحالة المثالية للتخدير (جدول المواد).
      ملاحظة: قم بتبديل مفتاح صمام الإنطلاق لضمان توصيل تدفق الهواء من مبخر آلة التخدير بقناع التخدير حتى يتم تخدير الفئران بالكامل.
  4. تحصين الفئران
    1. قم بحقن 200 ميكرولتر من المستحلب المحضر في الخطوة 1.2 تحت الجلد باستخدام حقنة سعة 1 مل مع الإبرة في أربعة مواقع على ظهر الفأر ، حوالي 0.5 سم على جانبي العمود الفقري في الإبط ومستوى الفخذ12 في فئران مجموعة EAE. استخدم 50 ميكرولتر من المستحلب في كل موقع (جدول المواد).
  5. حقن PTX
    1. أخرج الفئران من القفص عن طريق اصطياد الذيل ووضعه على سلك القفص. أمسك ذيل الفئران بالأصابع 4 و 5 واسحبه برفق للحفاظ على اتجاه الجسم والأطراف للأمام. أمسك رأس الفئران والتقط الجلد الموجود على ظهر الفئران باستخدام الأصابع الوسطى والبنصر
    2. في 0 ساعة و 48 ساعة بعد التحصين في الخطوة 1.4 ، يتم حقن 200 ميكرولتر من PTX داخل الصفاق في موضع 0.5 سم على طول جانبي خط منتصف البطن بعمق اختراق 1-2 سم باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة (جدول المواد).
      ملاحظة: قبل حقن PTX بعد 48 ساعة من تحصين MOG35-55 ، من الضروري تخدير الفئران باستخدام الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.3. يجب الاهتمام بالفئران حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على التكسير القصي.
    3. بالنسبة للفئران في المجموعة الضابطة ، عالج بالمحلول الملحي باستخدام نفس الطريقة وقم بتقييم النتيجة السريرية يوميا.
      ملاحظة: تم تقييم الفئران بحثا عن علامات EAE وفقا للمقياس التالي13: 0 = لا توجد أعراض مرضية ، 1 = شلل كامل في الذيل ، 2 = شلل / ضعف جزئي في الخلف ، 3 = شلل كامل في الأطراف الخلفية ، 4 = شلل الأطراف الأمامية والخلفية ، و 5 = حالة محتضرة.

2. تحليل التلوين النسيجي

  1. جمع الدماغ
    1. تخدير الفئران باتباع الخطوة 1.3. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وافتح الصدر لكشف القلب بالكامل. اقطع الأذن الزائدة وقم بتقطيعها ببطء باستخدام محلول ملحي مبرد مسبقا باستخدام حقنة سعة 20 مل بإبرة في البطين الأيسر حتى يصبح الكبد رماديا وأبيض.
    2. قم بتقطيع 4٪ بارافورمالدهايد حتى يظهر طرف الذيل ، ويصبح الجسم متيبسا ، ويصبح الكبد قاسيا. قطع رأس الرأس ، وقطع الجمجمة ، وجمع الدماغ باستخدام الملقط ، وإصلاحه في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة (جدول المواد).
  2. تحضير أقسام البارافين
    1. الجفاف المتدرج: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.1 على التوالي في 70٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 80٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 95٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، إيثانول لامائي لمدة ساعة واحدة ، استبدل بالإيثانول اللامائي الطازج ، استمر في الغمر لمدة ساعة واحدة (جدول المواد).
    2. الشفافية: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.2.1 في الزيلين لمدة 30 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر حتى تصبح الأنسجة شفافة (جدول المواد).
    3. التضمين: قم بتضمين أنسجة المخ من الخطوة 2.2.2 في البارافين لمدة ساعة واحدة ، واستبدلها بالبارافين الطازج ، واستمر في التضمين لمدة ساعة واحدة ، وتقطيعها إلى شرائح 6 ميكرومتر بعد تحرير القالب ، ووضع الشريحة في الماء الساخن ، وجففها عند 37 درجة مئوية ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (جدول المواد).
    4. إزالة الشمع: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.2.3 في الزيلين لمدة 20 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 20 دقيقة ، وضعها في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، 75٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بماء الصنبور (جدول المواد).
    5. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E): تلطيخ الأنسجة من الخطوة 2.2.4 بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق ثم اشطفه بماء الصنبور. عالج الأنسجة بمحلول تمايز الهيماتوكسيلين ، لفترة وجيزة واشطفها جيدا بماء الصنبور. عالج الأنسجة بمحلول الهيماتوكسيلين سكوت المزرق ، واشطفه بماء الصنبور. اغمر في 85٪ إيثانول لمدة 5 دقائق و 95٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، وقم بتلطيخ خطوات بصبغة اليوزين لمدة 5 دقائق (جدول المواد).
    6. التجفيف: اغمر الأنسجة من الخطوة 2.2.5 على التوالي في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، والزيلين لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، ثم أختمت باللثة المحايدة (جدول المواد).
    7. مراقبة أنسجة المخ باستخدام المجهر وإجراء الحصول على الصور وتحليلها (جدول المواد).

3. تحليل تلطيخ LFB

  1. مجموعة غمد المايلين: قم بقص العمود الفقري للفئران من طرف الرأس لأعلى 2 أجزاء إلى طرف الذيل لأسفل 2 أجزاء ، وقم بتفجير الحبل الشوكي إلى طرف الذيل ، وقم بإصلاح الحبل الشوكي في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم حصاد غمد المايلين من نفس الفئران في الخطوة 2.1 ، وخطوات نضح القلب هي نفسها كما في 2.1.
  2. أقسام البارافين إزالة البارافين وإعادة الجفاف: ضع الشرائح من الخطوة 3.1 على التوالي في الزيلين لمدة 20 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 20 دقيقة ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، واغسلها بماء الصنبور.
  3. تلطيخ أزرق سريع: ضع محلول تلطيخ أزرق سريع أ في فرن 60 درجة مئوية وقم بالتسخين المسبق لمدة 30 دقيقة. ضع الشرائح من الخطوة 3.2 في المحلول أ وقم بتغطيتها بغشاء بلاستيكي لمدة ساعة واحدة لمنع الشرائح من الجفاف ، ثم أخرج الشرائح واغسلها بسرعة بماء الصنبور.
  4. تمايز الخلفية: ضع الشرائح من الخطوة 3.3 في محلول تلطيخ أزرق سريع Luxol B لمدة 2 ثانية (بينما تكون الصبغة ساخنة) ، واغمر مباشرة في محلول تلطيخ أزرق سريع Luxol C للتمايز لمدة 15 ثانية ، واغسلها بالماء حتى يصبح غمد المايلين أزرق والخلفية عديمة اللون تقريبا.
  5. تلطيخ عداد الإيوسين: ضع الشرائح من الخطوة 3.4 في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية للتجفيف. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أخرجيها من الفرن واتركيها لتبرد. ضع الشرائح في 95٪ من الإيثانول واليوزين لمدة 1 دقيقة.
  6. الجفاف والختم: ضع الشرائح من الخطوة 3.5 على التوالي في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج مرة أخرى ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، والزيلين 5 دقائق ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق. اغسل وجفف العينات وأغلقها بالعلكة المحايدة.
  7. فحص المجهر: جمع الصور وتحليلها باستخدام مجهر بصري عمودي (جدول المواد).

4. تحليل قياس التدفق الخلوي

  1. افتح تجويف البطن للفئران. استخرج الطحال باستخدام الملقط وفرم إلى قطع صغيرة من 1.5-2.5 سم في PBS على الجليد باستخدام المقص. طحن الطحال في 10 مل من RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري للجنين (FBS) باستخدام مكبس حقنة سعة 2.5 مل وادفعه عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر للحصول على معلق أحادي الخلية (جدول المواد).
    ملاحظة: تم حصاد الطحال من نفس الفئران في الخطوة 2.1.
  2. انقل المعلق الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.1 إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بالتحلل باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء على الجليد لمدة 10 دقائق. يغسل باستخدام RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ FBS ، وجهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ FBS.
  3. عد الخلايا بعداد الخلايا التلقائي (جدول المواد) واضبط التركيز على 1 × 106 خلايا / مل.
  4. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب سعة 1.5 مل وتحتضن ب 1 ميكرولتر من الجسم المضاد CD16 / 32 المضادللفأر 14 (0.5 مجم / مل) لمدة 30 دقيقة لمنع التلوين غير المحدد. اغسل باستخدام RPMI-1640 وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من RPMI-1640 التي تحتوي على 2٪ FBS.
  5. وصمة عار بالأجسام المضادة الخاصة ب CD45 (Alexa Fluor 700) و CD3 (FITC) و CD4 (APC) و CD69 (BV674) لخلايا Teff15 لمدة 30 دقيقة ، 2 ميكرولتر لكل جسم مضاد. وصمة عار مع الأجسام المضادة الخاصة ب CD45 (Alexa Fluor 700) و CD3 (FITC) و CD4 (APC) و CD44 (BV421) و CD62L (PE) لخلايا Tem16 لمدة 30 دقيقة ، 2 ميكرولتر لكل جسم مضاد. يغسل باستخدام RPMI-1640 وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 350 ميكرولتر من PBS. تحليل نسبة الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي والبرنامج المرتبط به (جدول المواد).

5. تحليل السيتوكينات بواسطة مصفوفة حبة القياس الخلوي

  1. استخدم مجموعة حبة القياس الخلوي (جدول المواد) لقياس IL-2 و IL-4 و IL-6 و IL-10 و IL-17A وعامل نخر الورم (TNF) -α و IFN-γ في أدمغة الفئران ، والطرق كما هو موضح أدناه.
  2. اجمع دماغ الفأر كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  3. استخراج البروتين الكلي: قطع ووزن 50 مجم من أنسجة المخ (ثلاثة أدمغة في المجموعة الضابطة ، ومجموعة EAE في مرحلة الذروة ، ومرحلة RR). ضع الأدمغة في أنابيب سعة 1.5 مل وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على PMSF ومثبطات البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز.
  4. قطع الأدمغة إلى قطع صغيرة حوالي 1 مم3 ، واستخراجها بواسطة الخالط بالموجات فوق الصوتية عند 400 واط ، و 5 ثوان تشغيل و 5 ثوان ؛ كرر لمدة 5 أضعاف. ضع الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق ، وجهاز الطرد المركزي على حرارة 12000 × جم لمدة 5 دقائق ، واجمع المادة الطافية (جدول المواد).
  5. قم بإعداد معايير السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 للفأر كما هو موضح أدناه.
    1. افتح قارورة من معايير الماوس المجفف بالتجميد Th1 / Th2 / Th17. انقل المعايير إلى أنبوب بولي بروبلين مخروطي سعة 15 مل. قم بتسمية الجزء العلوي من الأنبوب كمعيار.
    2. أعد تشكيل المعايير في 2.0 مل من مخفف الفحص. اسمح للمعيار المعاد تشكيله بالتوازن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. امزج البروتين المعاد تكوينه برفق عن طريق سحب العينات.
    3. قم بتسمية أنابيب 12 مم × 75 مم ورتبها بترتيب التخفيف التالي: 1: 2 ، 1: 4 ، 1: 8 ، 1:16 ، 1:32 ، 1:64 ، 1: 128 ، و 1: 256. الماصة 300 ميكرولتر من مخفف الفحص في كل أنبوب مسمى.
    4. إجراء التخفيفات التسلسلية: انقل 300 ميكرولتر من أعلى مستوى إلى أنبوب التخفيف 1:2 واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. استمر في التخفيفات التسلسلية عن طريق نقل 300 ميكرولتر من الأنبوب 1: 2 إلى الأنبوب 1: 4 وهكذا حتى الأنبوب 1: 256. قم بإعداد أنبوب 12 مم × 75 مم يحتوي فقط على مخفف الفحص ليكون بمثابة تحكم سلبي 0 بيكوغرام / مل.
      ملاحظة: امزج جيدا عن طريق سحب العينات. لا تقم بالدوامة لمنع اقتران الأجسام المضادة على الميكروبيدات من السقوط.
    5. لخلط حبات التقاط السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 للفأر ، قم بإعداد 19 أنبوبا ، بما في ذلك المعايير التي تحتوي على 3 عينات في كل مجموعة (المجموعة الضابطة ، ومجموعة EAE في مرحلة الذروة ، ومرحلة RR) للتجربة. دوامة تعليق حبة الالتقاط بقوة لمدة 5 ثوان قبل الخلط. أضف 190 ميكرولتر من كل حبة التقاط في أنبوب واحد وقم بتسميتها بخرز التقاط مختلط. دوامة خليط الخرز جيدا.
      ملاحظة: ستستقر الخرزات المترافقة بالأجسام المضادة من التعليق بمرور الوقت. من الضروري دوامة القارورة قبل أخذ حصة معلقة من الخرز.
    6. لإجراء الفحص ، قم بتدوير الخرز الكهربائي للمزيج. أضف 50 ميكرولتر من الخرز إلى جميع أنابيب الفحص. أضف 50 ميكرولتر من التخفيفات القياسية للسيتوكين Th1 / Th2 / Th17 إلى أنابيب التحكم كما في الجدول 1.
    7. أضف 50 ميكرولتر من كاشف الكشف عن الماوس Th1 / Th2 / Th17 PE إلى جميع أنابيب الفحص. احتضان أنابيب الفحص لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وحمايتها من الضوء. أضف 1 مل من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل أنبوب فحص وجهاز طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق وتخلص من المادة الطافية من كل أنبوب فحص بعناية.
    8. أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل أنبوب فحص لإعادة تعليق حبيبات الخرزة. قم بتحليل بيانات السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 بالماوس باستخدام برنامج FCAP Array (جدول المواد).

  

النتائج

تقييم الدرجات السريرية
كما هو موضح في الشكل 1 ، لم تظهر على الفئران في المجموعة الضابطة أي أعراض سريرية. أظهرت الفئران في مجموعة EAE ، التي تم تحصينها ب MOG35-55 ، شلل الذيل بعد حوالي 12 يوما من التحصين. بحلول اليوم 16 ، وصلت الأعراض إلى شلل كامل في الأطر...

Discussion

مرض التصلب العصبي المتعدد هو أكثر أمراض إزالة الميالين المناعي الذاتي انتشارا في الجهاز العصبي المركزي ، والذي يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاءالعالم 17. EAE هو النموذج الحيواني النموذجي لمحاكاة السمات المرضية السريرية ل MS18. أظهرت الدراسات أن ا...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في نينغشيا (2022AAC03601 و 2023AAC02087) ومؤسسة الأبحاث بجامعة نينغشيا الطبية (XM2019052). شكرا لدعم مركز أبحاث العلوم والتكنولوجيا الطبية بجامعة نينغشيا الطبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machine evaporatorNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.792632
70 μm cell strainerXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103128
APC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100616
Automatic cell counterJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 AntibodyBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction KitShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. SLCH4887
DehydratorDIAPATHDonatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)Yikang Group210820
Dyeing machineDIAPATHGiotto
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EthanolSCRC100092683
Fetal Bovine SerumProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Glass slideServicebioG6004
HE dye solution setServicebioG1003
Hematoxylin-Eosin solutionServicebioG1002
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Imaging systemNikonNIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kitServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Neutral gumSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Pathology slicerLeicaRM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Pipette 0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
Pipette 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
Pipette 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.PM150110
Tee valveGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Tissue spreaderZhejiang Kehua Instrument Co.,LtdKD-P
Upright optical microscopeNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418

References

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888 (2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156 (2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357 (2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204 (2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390 (2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60 (2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508 (2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573 (2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280 (2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239 (2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173 (2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411 (2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CD4 MOG35 55 Th1 Th17

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved