Rôle des lymphocytes T CD4 dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale récurrente-rémittente

Résumé

Un modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) chez la souris a été utilisé pour étudier le rôle des lymphocytes T CD4 dans la phase initiale et la rechute de l’EAE du point de vue de la phase d’activation et de la fonction de l’effet immunitaire.

Résumé

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune caractérisée par l’infiltration de cellules immunitaires et la démyélinisation du système nerveux central (SNC). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) sert de modèle animal prototype pour l’étude de la SEP. Dans cette étude, nous avons cherché à étudier le rôle des lymphocytes T CD4 dans l’initiation et la rechute de l’EAE, en nous concentrant sur la phase d’activation et la réponse immunitaire. Pour créer le modèle de souris EAE, des souris femelles ont été immunisées avec de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG)35-55 émulsionnée avec un adjuvant de Freund complet (CFA). Les scores cliniques ont été évalués quotidiennement et les résultats ont démontré que les souris du groupe EAE présentaient un schéma cyclique classique. L’analyse de la coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et au luxol fast blue (LFB) a révélé une infiltration significative de cellules inflammatoires dans le SNC et une démyélinisation chez les souris EAE. En ce qui concerne la phase d’activation, les lymphocytes T effecteurs CD4⁺CD69⁺ (Teff) et les lymphocytes T effecteurs mémoires CD4⁺CD44⁺CD62L^- (Tem) peuvent contribuer à l’initiation de l’EAE, cependant, la phase de rechute a probablement été dominée par les lymphocytes CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. De plus, en termes de fonction immunitaire, les cellules T (Th)1 auxiliaires sont principalement impliquées dans l’initiation de l’EAE. Cependant, les cellules Th1 et Th17 contribuent toutes deux à la phase de rechute, et la fonction immunosuppressive des cellules T régulatrices (Treg) a été inhibée au cours du processus pathologique de l’EAE.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune caractérisée par l’infiltration du système nerveux central (SNC) par des cellules immunitaires et une démyélinisation ^1,2. Une étude récente a montré qu’il s’agissait de la maladie invalidante la plus fréquente chez les jeunes, avec une incidence en constante augmentation dans le monde³. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal prototype de la SP qui simule de nombreux aspects de la phase inflammatoire de la SP⁴ chez l’humain. Du point de vue des fonctions immunitaires, les lymphocytes T CD4 initiaux qui n’ont pas encore rencontré d’antigènes sont appelés lymphocytes T(Th) 0 auxiliaires. Ces cellules subissent des processus de maturation et d’activation pour présenter diverses fonctions. Les lymphocytes T CD4 peuvent être classés en plusieurs sous-ensembles en fonction de leurs fonctions spécifiques, qui comprennent les cellules Th1, Th2, T régulatrice (Treg), T auxiliaire folliculaire (Tfh), Th17, Th9 et Th22⁵. Il est communément admis que les sous-types de cellules Th1 et Th17 sont des facteurs de pathogenèse cruciaux de l’EAE⁶. Les cellules Th1 pourraient sécréter de l’interféron γ (IFN-γ), et les cellules Th17 sécrètent de l’interleukine (IL)-17 et d’autres facteurs inflammatoires, qui pourraient activer d’autres cellules immunitaires comme les cellules microgliales et les astrocytes. Ces cellules produisent des cytokines inflammatoires⁷, telles que l’IL-18, l’IL-12, l’IL-23 et l’IL-1β, qui pourraient induire davantage la réponse immunitaire des cellules Th1/Th17, entraînant une démyélinisation progressive et des lésions axonales. Du point de vue de la phase d’activation, les lymphocytes T CD4 possèdent un destin prédéterminé pour se développer en sous-ensembles cellulaires distincts et en états différenciés, y compris les lymphocytes T naïfs, effecteurs et mémoires⁸. Les lymphocytes T CD4 initiaux prolifèrent et se différencient en une variété de sous-ensembles effecteurs ayant des fonctions différentes dans différents environnements⁹. La plupart des cellules effectrices ont une courte durée de vie, avec une petite population de cellules T se transformant en cellules T mémoires qui présentent des fonctions effectrices rapides lorsqu’elles rencontrent à nouveau les mêmes antigènes et fournissent à l’hôte une protection très puissante et à long terme^10,11.

Bien que les recherches actuelles suggèrent que les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans le développement de l’EAE, on ne sait toujours pas comment les différents sous-ensembles de lymphocytes T CD4, classés en fonction de leur phase d’activation et de leur fonction d’effet immunitaire, contribuent à l’initiation et à la rechute de l’EAE. Dans la présente étude, nous avons établi le modèle EAE chez des souris C57BL6/J en immunisant le peptide myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 et étudié l’initiation et la rechute de l’EAE, en nous concentrant sur la phase d’activation et la fonction immunitaire des lymphocytes T CD4.

Protocole

Un total de 18 souris femelles C57BL/6J âgées de six à huit semaines ont été divisées au hasard en un groupe témoin (n = 6) et un groupe EAE (n = 12) pour cette étude. Les souris ont été achetées au centre d’expérimentation animale de l’Université de médecine du Ningxia. Les souris ont été logées dans une pièce à température et humidité contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à de l’eau douce et à de la nourriture. L’approbation éthique a été obtenue du Comité d’éthique des animaux d’expérimentation de l’Université de médecine du Ningxia avant le début de l’étude.

1. Développement de l’EAE récurrente-rémittente chez les souris C57BL/6

1. Dissolution du réactif
   1. Dissoudre 5,4 mg de MOG35-55 (Table des matières) dans 1,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Peser 12,6 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (tableau des matériaux) et l’ajouter à 1,8 mL de solution complète d’adjuvant de Freund (CFA) (tableau des matériaux). Dissoudre 360 μL de toxine coqueluche (PTX ; Table des matériaux) dans 7,2 mL de PBS à l’aide d’une pipette (Table of Materials).
2. Préparation de l’émulsion de MOG35-55 et CFA
   1. Pipeter la solution MOG35-55 et la solution CFA à l’aide de deux seringues de 5 mL préparées à l’étape 1.1 et les connecter à l’aide d’un robinet en T. Mélanger continuellement sur de la glace pendant 1 h jusqu’à l’obtention d’une émulsion laiteuse d’eau dans l’huile.
      REMARQUE : L’émulsion est préparée avec succès lorsqu’elle flotte à la surface de l’eau sans se disperser après l’avoir laissée tomber dans l’eau.
3. Anesthésie chez la souris
   1. Dévissez le capuchon du joint de remplissage à l’extrémité avant de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie. Versez lentement 20 ml d’isoflurane le long de la vis d’étanchéité au centre et verrouillez le bouchon de remplissage. Commutez l’interrupteur de la vanne en T pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est communiqué avec le boîtier d’induction de l’anesthésie (tableau des matériaux).
   2. Connectez l’alimentation électrique de la pompe à air, allumez l’interrupteur de la pompe à air, puis tournez et ajustez la vanne de source d’air à l’extrémité avant du débitmètre d’oxygène de sorte que le débit de gaz de sortie soit de 400 ml/min. Ouvrez l’évaporateur, ajustez la concentration d’induction à 3 % et attendez que l’anesthésique remplisse la boîte d’induction.
   3. Environ 1 minute plus tard, placez les souris dans la boîte d’induction, puis fermez la boîte d’induction et attendez que les souris soient dans un sommeil profond, une relaxation musculaire et une respiration régulière ; ensuite, les souris pourraient être déterminées comme l’état idéal de l’anesthésie (Table des matériaux).
      REMARQUE : Commutez l’interrupteur de la vanne en T pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est communiqué avec le masque d’anesthésie jusqu’à ce que les souris soient complètement anesthésiées.
4. Immunisation chez la souris
   1. Injecter par voie sous-cutanée 200 μL d’émulsion préparée à l’étape 1.2 à l’aide d’une seringue de 1 mL avec l’aiguille à quatre endroits sur le dos de la souris, à environ 0,5 cm des deux côtés de la colonne vertébrale à l’aisselle et dans le plan de l’aine¹² chez les souris du groupe EAE. Utiliser 50 μL d’émulsion à chaque site (tableau des matériaux).
5. Injection PTX
   1. Sortez les souris de la cage en attrapant la queue et placez-la sur le fil de la cage. Tenez la queue des souris avec les 4ème et 5ème doigts et tirez-la doucement vers le haut pour maintenir la tendance du corps et des membres vers l’avant. Saisissez la tête des souris et capturez la peau sur le dos des souris à l’aide du majeur et de l’annulaire.
   2. À 0 h et 48 h après l’immunisation, à l’étape 1.4, injecter 200 μL de PTX par voie intrapéritonéale à une position de 0,5 cm de chaque côté de la ligne médio-abdominale avec une profondeur de pénétration de 1 à 2 cm à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille (tableau des matières).
      REMARQUE : Avant d’injecter PTX 48 h après l’immunisation de MOG35-55, il est nécessaire d’anesthésier les souris en utilisant les procédures décrites à l’étape 1.3. Les souris doivent être soignées jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment de conscience pour maintenir leur décubitus sternal.
   3. Pour les souris du groupe témoin, traitez avec une solution saline en utilisant la même méthode et évaluez quotidiennement le score clinique.
      REMARQUE : Les souris ont été évaluées pour détecter des signes d’EAE selon l’échelle suivante¹³ : 0 = aucun symptôme de la maladie, 1 = paralysie complète de la queue, 2 = paralysie/faiblesse partielle de l’arrière-train, 3 = paralysie complète des membres postérieurs, 4 = paralysie des membres antérieurs et postérieurs et 5 = état moribond.

2. Analyse histologique de la coloration

1. Collecte de cerveaux
   1. Anesthésez les souris en suivant l’étape 1.3. Euthanasiez les souris par luxation cervicale et ouvrez la poitrine pour exposer complètement le cœur. Coupez l’auricule dextra et perfusez-le lentement avec une solution saline pré-refroidie à l’aide d’une seringue de 20 ml avec une aiguille au ventricule gauche jusqu’à ce que le foie devienne gris et blanc.
   2. Perfuser lentement avec 4 % de paraformaldéhyde jusqu’à ce que le bout de la queue se retourne, que le corps devienne raide et que le foie devienne dur. Décapitez la tête, coupez le crâne, récupérez le cerveau à l’aide d’une pince à épiler et fixez-le dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h (tableau des matériaux).
2. Préparation des sections de paraffine
   1. Déshydratation par gradient : Immerger successivement les tissus cérébraux de l’étape 2.1 dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 h, de l’éthanol à 80 % pendant 1 h, de l’éthanol à 95 % pendant 1 h, de l’éthanol anhydre pendant 1 h, remplacer par de l’éthanol anhydre frais, poursuivre l’immersion pendant 1 h (Table des matériaux).
   2. Transparence : Immergez les tissus cérébraux de l’étape 2.2.1 dans du xylène pendant 30 min, remplacez-les par du xylène frais et continuez à immerger jusqu’à ce que les tissus soient transparents (tableau des matériaux).
   3. Enrobage : Incorporer les tissus cérébraux de l’étape 2.2.2 dans de la paraffine pendant 1 h, les remplacer par de la paraffine fraîche, poursuivre l’enrobage pendant 1 h, couper en tranches de 6 μm après le démoulage du moule, placer la lame dans de l’eau chaude, sécher à 37 °C, conserver à température ambiante (tableau des matériaux).
   4. Déparaffinage : Immerger les tissus cérébraux de l’étape 2.2.3 dans du xylène pendant 20 min, les remplacer par du xylène frais, poursuivre l’immersion pendant 20 min, les placer dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, les immerger pendant 5 min, de l’éthanol à 75 % pendant 5 min, rincer à l’eau du robinet (tableau des matériaux).
   5. Coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) : Teindre les tissus à partir de l’étape 2.2.4 avec une solution d’hématoxyline pendant 3 à 5 min, puis rincer à l’eau du robinet. Traitez les tissus avec une solution de différenciation de l’hématoxyline, brièvement et rincez abondamment à l’eau du robinet. Traitez les tissus avec la solution de bleuissement du robinet d’hématoxyline Scott et rincez à l’eau du robinet. Immergez dans de l’éthanol à 85 % pendant 5 min et de l’éthanol à 95 % pendant 5 min, et colorez les étapes avec un colorant à l’éosine pendant 5 min (tableau des matériaux).
   6. Déshydrater : Immerger successivement les tissus de l’étape 2.2.5 dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, poursuivre l’immersion pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, les immerger pendant 5 min, les placer dans du xylène frais, les remplacer par du xylène frais, les immerger pendant 5 min, les fermer avec de la gomme neutre (Table des matières).
   7. Observer au microscope les tissus cérébraux et effectuer l’acquisition et l’analyse d’images (Table des matériaux).

3. Analyse de la coloration LFB

1. Collection de gaines de myéline : Coupez la colonne vertébrale de la souris de la terminaison de la tête vers le haut de 2 segments jusqu’à la terminaison de la queue vers le bas de 2 segments, soufflez la moelle épinière jusqu’à la terminaison de la queue et fixez la moelle épinière dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h.
   REMARQUE : La gaine de myéline a été prélevée sur les mêmes souris à l’étape 2.1, et les étapes de la perfusion cardiaque sont les mêmes qu’à l’étape 2.1.
2. Déparaffinisation et réhydratation des sections de paraffine : Placez successivement les lames de l’étape 3.1 dans du xylène pendant 20 min, remplacez-les par du xylène frais, poursuivez l’immersion pendant 20 min, de l’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacez-les par de l’éthanol anhydre frais, immergez-les pendant 5 min, avec de l’alcool à 75 % pendant 5 min, lavez à l’eau du robinet.
3. Coloration bleue rapide : Placez la solution de coloration bleue rapide Luxol A dans un four à 60 °C et préchauffez pendant 30 min. Mettez les lames de l’étape 3.2 dans la solution A et couvrez-les d’une membrane plastique pendant 1 h pour éviter que les tranches ne se dessèchent, puis retirez les lames et lavez-les rapidement à l’eau du robinet.
4. Différenciation de l’arrière-plan : Placez les lames de l’étape 3.3 dans la solution B de coloration bleue rapide Luxol pendant 2 s (pendant que le colorant est chaud), et immergez-les directement dans la solution C de coloration bleue rapide Luxol pour la différenciation pendant 15 s, lavez à l’eau jusqu’à ce que la gaine de myéline soit bleue et que le fond soit presque incolore.
5. Coloration du comptoir à l’éosine : Mettez les lames de l’étape 3.4 dans le four à 65 °C pour le séchage. Une fois cela fait, retirez-les du four et laissez-les refroidir. Mettez les lames dans de l’éthanol à 95 % et de l’éosine pendant 1 min.
6. Déshydratation et scellement : Placez successivement les lames de l’étape 3.5 dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacez-les par de l’éthanol anhydre frais, poursuivez l’immersion pendant 5 min, remplacez à nouveau par de l’éthanol anhydre frais, continuez à immerger pendant 5 min, du xylène 5 min, remplacez par du xylène frais, immergez pendant 5 min. Lavez et séchez les échantillons et scellez-les avec de la gomme neutre.
7. Examen au microscope : Recueillir et analyser des images à l’aide d’un microscope optique droit (Table des matériaux).

4. Analyse par cytométrie en flux

1. Ouvrez la cavité abdominale des souris. Extrayez la rate à l’aide d’une pince à épiler et coupez-la en petits morceaux de 1,5 à 2,5 cm dans du PBS sur de la glace à l’aide de ciseaux. Broyer la rate dans 10 mL de RPMI-1640 contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) à l’aide d’un piston de seringue de 2,5 mL et la pousser à travers une crépine à cellules de 70 μm pour obtenir une suspension unicellulaire (Table des matériaux).
   REMARQUE : Les rates ont été prélevées sur les mêmes souris à l’étape 2.1.
2. Transvaser la suspension obtenue à l’étape 4.1 dans des tubes de 15 mL et lyser à l’aide de 5 mL de tampon de lyse des globules rouges sur de la glace pendant 10 min. Laver avec du RPMI-1640 contenant 2 % de FBS, centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec du RPMI-1640 contenant 2 % de FBS.
3. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules (Table des matériaux) et ajustez la concentration à 1 x 10⁶ cellules/mL.
4. Pipeter 100 μL de suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL et incuber avec 1 μL d’anticorps anti-CD16/32¹⁴ (0,5 mg/mL) pendant 30 min pour bloquer la coloration non spécifique. Laver avec le RPMI-1640 et centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de RPMI-1640 contenant 2 % de FBS.
5. Coloration avec des anticorps spécifiques pour CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) et CD69 (BV674) pour les cellules de teff¹⁵ pendant 30 min, 2 μL pour chaque anticorps. Coloration avec des anticorps spécifiques pour CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) et CD62L (PE) pour les cellules Tem¹⁶ pendant 30 min, 2 μL pour chaque anticorps. Laver avec le RPMI-1640 et centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 350 μL de PBS. Analysez les proportions cellulaires à l’aide d’un cytomètre en flux et du logiciel associé (Table des matériaux).

5. Analyse des cytokines par réseau de billes cytométriques

1. Utilisez le réseau de billes cytométriques (Table des matériaux) pour mesurer l’IL-2, l’IL-4, l’IL-6, l’IL-10, l’IL-17A, le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et l’IFN-γ dans le cerveau des souris, selon les méthodes décrites ci-dessous.
2. Récupérez le cerveau de la souris comme décrit à l’étape 2.1.
3. Extraction de protéines totales : Coupez et pesez 50 mg de tissu cérébral (trois cerveaux dans le groupe témoin, le groupe EAE au stade maximal et le stade RR). Placez les cerveaux dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez 500 μL de tampon de lyse contenant du PMSF, un inhibiteur de protéase et des inhibiteurs de phosphatase.
4. Découper les cerveaux en petits morceaux d’environ 1 mm³, extraire par homogénéisateur à ultrasons à 400 W, 5 s ON et 5 s OFF ; Répétez l’opération 5 fois. Placez le tube sur de la glace pendant 10 min, centrifugez à 12000 x g pendant 5 min et récupérez le surnageant (tableau des matériaux).
5. Préparez les étalons de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris comme décrit ci-dessous.
   1. Ouvrez un flacon d’étalons de souris lyophilisés Th1/Th2/Th17. Transvasez les étalons dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Étiquetez le haut du tube en standard.
   2. Reconstituer les étalons dans 2,0 mL de diluant de dosage. Laisser l’étalon reconstitué s’équilibrer pendant 15 min à température ambiante. Mélangez délicatement la protéine reconstituée par pipetage.
   3. Étiquetez les tubes de 12 mm x 75 mm et disposez-les dans l’ordre de dilution suivant : 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 et 1:256. Pipeter 300 μL de diluant de dosage dans chaque tube marqué.
   4. Effectuer des dilutions en série : Transvaser 300 μL de l’étalon supérieur dans le tube de dilution 1:2 et bien mélanger par pipetage. Poursuivez les dilutions en série en transférant 300 μL du tube 1:2 au tube 1:4 et ainsi de suite jusqu’au tube 1:256. Préparez un tube de 12 mm x 75 mm contenant uniquement le diluant de dosage qui servira de témoin négatif à 0 pg/mL.
      REMARQUE : Bien mélanger par pipetage. Ne pas vortex pour empêcher le couplage des anticorps sur les microbilles de tomber.
   5. Pour mélanger les billes de capture de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris, préparez 19 tubes, y compris des étalons avec 3 échantillons dans chaque groupe (groupe témoin, groupe EAE au stade de pointe et stade RR) pour l’expérience. Agiter vigoureusement la suspension de la bille de capture pendant 5 s avant de mélanger. Ajoutez 190 μL de chaque cordon de capture dans un seul tube et étiquetez-le comme un mélange de billes de captage. Tourbillonnez soigneusement le mélange de billes.
      REMARQUE : Les billes conjuguées aux anticorps se déposeront hors de la suspension au fil du temps. Il est nécessaire de vortex le flacon avant de prélever une aliquote de suspension de billes.
   6. Pour effectuer le test, vortex les billes de capture du mélange. Ajouter 50 μL de billes dans tous les tubes de dosage. Ajouter 50 μL de dilutions standard de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris dans les tubes témoins, comme indiqué dans le tableau 1.
   7. Ajouter 50 μL de réactif de détection PE Th1/Th2/Th17 de souris dans tous les tubes de test. Incuber les tubes de dosage pendant 2 h à température ambiante et les protéger de la lumière. Ajouter 1 mL de tampon de lavage dans chaque tube d’essai et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant de chaque tube de dosage.
   8. Ajouter 300 μL de tampon de lavage dans chaque tube de dosage pour remettre la bille en suspension. Analysez les données de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris à l’aide du logiciel FCAP Array (Table of Materials).

  

Résultats

Évaluation des scores cliniques
Comme le montre la figure 1, les souris du groupe témoin n’ont présenté aucun symptôme clinique. Les souris du groupe EAE, qui ont été immunisées avec MOG35-55, ont présenté une paralysie de la queue environ 12 jours après l’immunisation. Au 16e jour, les symptômes ont atteint une paralysie complète des membres postérieurs (définie comme le stade de pointe, Peak). Après cela, les symptô...

Discussion

La SEP est la maladie démyélinisante auto-immune la plus répandue du SNC, qui touche des millions de personnes dans le monde¹⁷. L’EAE est le modèle animal typique pour simuler les caractéristiques pathologiques cliniques de la SEP¹⁸. Des études ont démontré que les personnes atteintes de SP présentent des troubles cognitifs et d’autres handicaps dus à la dégénérescence des axones et des neurones du SNC 19,20,21.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine evaporator	Norvap	20-17368
Isoflurane	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	792632
70 μm cell strainer	XIYAN Co.,Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103128
APC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100616
Automatic cell counter	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Complete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	SLCH4887
Dehydrator	DIAPATH	Donatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)	Yikang Group	210820
Dyeing machine	DIAPATH	Giotto
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Fetal Bovine Serum	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Glass slide	Servicebio	G6004
HE dye solution set	Servicebio	G1003
Hematoxylin-Eosin solution	Servicebio	G1002
High speed refrigerated centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Imaging system	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kit	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Neutral gum	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Oven	Labotery	GFL-230
Pathology slicer	Leica	RM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Pipette 0.5-10 μL	DLAB Scientific	7010101004
Pipette 100-1000 μL	DLAB Scientific	7010101014
Pipette 20-200 μL	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	PM150110
Tee valve	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd	KD-P
Upright optical microscope	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xylene	SCRC	10023418