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Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Ein experimentelles Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) an Mäusen wurde eingesetzt, um die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Entstehung und dem Rückfall von EAE aus der Perspektive der Aktivierungsphase und der Immuneffektfunktion zu untersuchen.
Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration von Immunzellen und die Demyelinisierung des Zentralnervensystems (ZNS) gekennzeichnet ist. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als prototypisches Tiermodell für die Untersuchung von MS. In dieser Studie wollten wir die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Initiierung und dem Rückfall von EAE untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf der Aktivierungsphase und der Immunantwort lag. Um das EAE-Mausmodell zu erstellen, wurden weibliche Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 immunisiert, das mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA) emulgiert wurde. Die klinischen Scores wurden täglich ausgewertet und zeigten, dass die Mäuse in der EAE-Gruppe ein klassisches schubförmig-remittierendes Muster aufwiesen. Die Analyse von Hämatoxylin-Eosin (H&E) und Luxol Fast Blue (LFB) zeigte eine signifikante Infiltration von Entzündungszellen im ZNS und eine Demyelinisierung bei EAE-Mäusen. In Bezug auf die Aktivierungsphase können sowohl CD4+CD69+ Effektor-T (Teff)-Zellen als auch CD4+CD44+CD62L-Effektor-Memory T (Tem)-Zellen zur Initiierung von EAE beitragen, wobei das Rezidivstadium wahrscheinlich von CD4+CD44+CD62L-Tem-Zellen dominiert wurde. Darüber hinaus sind in Bezug auf die Immunfunktion Helferzellen T (Th)1 hauptsächlich an der Initiierung der EAE beteiligt. Allerdings tragen sowohl Th1- als auch Th17-Zellen zum Schubstadium bei, und die immunsuppressive Funktion der regulatorischen T-Zellen (Treg) wurde während des EAE-pathologischen Prozesses gehemmt.
Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration des Zentralnervensystems (ZNS) mit Immunzellen und Demyelinisierung gekennzeichnet ist 1,2. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass es sich um die häufigste Behinderungskrankheit bei jungen Menschen handelt, deren Inzidenz weltweit kontinuierlich zunimmt3. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein prototypisches Tiermodell für MS, das viele Aspekte der Entzündungsphase der menschlichen MSsimuliert 4. Aus Sicht der Immunfunktionen werden die initialen CD4-T-Zellen, die noch nicht auf Antigene gestoßen sind, als T(Th)-0-Helferzellen bezeichnet. Diese Zellen durchlaufen Reifungs- und Aktivierungsprozesse, um verschiedene Funktionen zu erfüllen. CD4-T-Zellen können nach ihren spezifischen Funktionen in mehrere Untergruppen eingeteilt werden, zu denen Th1, Th2, regulatorisches T (Treg), follikuläres Helfer-T (Tfh), Th17-, Th9- und Th22-Zellen gehören5. Es ist ein allgemeiner Konsens, dass die Zellsubtypen Th1 und Th17 entscheidende Pathogenesefaktoren von EAE6 sind. Th1-Zellen könnten Interferon γ (IFN-γ) sezernieren, und Th17-Zellen sezernieren Interleukin (IL)-17 und andere Entzündungsfaktoren, die andere Immunzellen wie Mikrogliazellen und Astrozyten aktivieren könnten. Diese Zellen produzieren entzündliche Zytokine7 wie IL-18, IL-12, IL-23 und IL-1β, die die Immunantwort der Th1/Th17-Zellen weiter induzieren könnten, was zu einer fortschreitenden Demyelinisierung und axonalen Schäden führt. Aus der Perspektive der Aktivierungsphase haben CD4-T-Zellen ein vorherbestimmtes Schicksal, sich zu unterschiedlichen Zelluntergruppen und differenzierten Zuständen zu entwickeln, einschließlich naiver, Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen8. Die anfänglichen CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Effektor-Untergruppen mit unterschiedlichen Funktionen in verschiedenen Umgebungen9. Die meisten Effektorzellen sind kurzlebig, wobei sich eine kleine Population von T-Zellen zu Gedächtnis-T-Zellen entwickelt, die bei der Wiederbegegnung mit denselben Antigenen schnelle Effektorfunktionen aufweisen und dem Wirt einen hochwirksamen und langfristigen Schutz bieten 10,11.
Obwohl aktuelle Forschungsergebnisse darauf hindeuten, dass CD4-T-Zellen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von EAE spielen, ist noch unklar, wie verschiedene CD4-T-Zell-Untergruppen, klassifiziert nach ihrer Aktivierungsphase und Immunwirkungsfunktion, zur Initiierung und zum Rückfall von EAE beitragen. In der vorliegenden Studie etablierten wir das EAE-Modell in C57BL6/J-Mäusen durch Immunisierung des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG)35-55-Peptids und untersuchten die Initiierung und den Rückfall von EAE, wobei wir uns auf die Aktivierungsphase und die Immunfunktion von CD4-T-Zellen konzentrierten.
Insgesamt wurden für diese Studie 18 weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen nach dem Zufallsprinzip in eine Kontrollgruppe (n = 6) und eine EAE-Gruppe (n = 12) eingeteilt. Die Mäuse wurden vom Versuchstierzentrum der Ningxia Medical University gekauft. Die Mäuse wurden in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu frischem Wasser und Futter untergebracht. Die Ethikgenehmigung wurde vor Beginn der Studie von der Ethikkommission für Versuchstiere der Ningxia Medical University eingeholt.
1. Entwicklung einer schubförmig remittierenden EAE bei C57BL/6-Mäusen
2. Histologische Färbeanalyse
3. Analyse der LFB-Färbung
4. Durchflusszytometrische Analyse
5. Analyse von Zytokinen mittels zytometrischem Bead-Array
Bewertung der klinischen Ergebnisse
Wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigten die Mäuse in der Kontrollgruppe keine klinischen Symptome. Die Mäuse in der EAE-Gruppe, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, zeigten etwa 12 Tage nach der Immunisierung eine Schwanzlähmung. Am 16. Tag erreichten die Symptome eine vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen (definiert als Spitzenstadium, Peak). Danach ließen die Symptome allmählich nach. Die k...
MS ist die häufigste demyelinisierende Autoimmunerkrankung des ZNS, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind17. Die EAE ist das typische Tiermodell zur Simulation der klinischen pathologischen Merkmale von MS18. Studien haben gezeigt, dass Menschen mit MS aufgrund der Degeneration von Axonen und Neuronen im ZNS kognitive Beeinträchtigungen und andere Behinderungen erleiden 19,20,21.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of Ningxia (2022AAC03601 und 2023AAC02087) und der Research Foundation der Ningxia Medical University (XM2019052) unterstützt. Vielen Dank für die Unterstützung des Medical Science and Technology Research Center der Ningxia Medical University.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia machine evaporator | Norvap | 20-17368 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 792632 | |
70 μm cell strainer | XIYAN Co.,Ltd. | 15-1070 | |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103128 | |
APC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100616 | |
Automatic cell counter | Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD | JIMBIO iCyta S2 | |
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit | BD Biosciences | 560485 | |
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101303 | |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody | Biolegend | 104532 | |
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14) | BD Pharmingen | 563109 | |
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd | PC201Plus | |
Complete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLCH4887 | |
Dehydrator | DIAPATH | Donatello | |
Disposable sterilized syringe (1 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (2.5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Dyeing machine | DIAPATH | Giotto | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Ethanol | SCRC | 100092683 | |
Fetal Bovine Serum | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | FSP500 | |
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11) | BD Pharmingen | 553062 | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCelesta | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | Accuri C6 | |
Flow Jo software | BD Biosciences | 10.8.1 | |
Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Glass slide | Servicebio | G6004 | |
HE dye solution set | Servicebio | G1003 | |
Hematoxylin-Eosin solution | Servicebio | G1002 | |
High speed refrigerated centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Mogafugo8R | |
Imaging system | Nikon | NIKON DS-U3 | |
Luxol fast blue staining kit | Servicebio | G1030 | |
Ms CD44 BV421 IM7 | BD Pharmingen | 564970 | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | BD Pharmingen | 231141 | |
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) | AnaSpec | AS-60130-1 | |
Neutral gum | SCRC | 10004160 | |
Organizer | KEDEE | KD-P | |
Oven | Labotery | GFL-230 | |
Pathology slicer | Leica | RM2016 | |
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | P7208 | |
Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
Pipette 0.5-10 μL | DLAB Scientific | 7010101004 | |
Pipette 100-1000 μL | DLAB Scientific | 7010101014 | |
Pipette 20-200 μL | DLAB Scientific | 7010101009 | |
RPMI-1640 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | PM150110 | |
Tee valve | Guangdong Kanghua Medical Co., LTD | A06 | |
Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd | KD-P | |
Upright optical microscope | Nikon | NIKON ECLIPSE E100 | |
Xylene | SCRC | 10023418 |
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