Die Rolle der CD4-T-Zellen bei der schubförmig-remittierenden experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Zusammenfassung

Ein experimentelles Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) an Mäusen wurde eingesetzt, um die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Entstehung und dem Rückfall von EAE aus der Perspektive der Aktivierungsphase und der Immuneffektfunktion zu untersuchen.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration von Immunzellen und die Demyelinisierung des Zentralnervensystems (ZNS) gekennzeichnet ist. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als prototypisches Tiermodell für die Untersuchung von MS. In dieser Studie wollten wir die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Initiierung und dem Rückfall von EAE untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf der Aktivierungsphase und der Immunantwort lag. Um das EAE-Mausmodell zu erstellen, wurden weibliche Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 immunisiert, das mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA) emulgiert wurde. Die klinischen Scores wurden täglich ausgewertet und zeigten, dass die Mäuse in der EAE-Gruppe ein klassisches schubförmig-remittierendes Muster aufwiesen. Die Analyse von Hämatoxylin-Eosin (H&E) und Luxol Fast Blue (LFB) zeigte eine signifikante Infiltration von Entzündungszellen im ZNS und eine Demyelinisierung bei EAE-Mäusen. In Bezug auf die Aktivierungsphase können sowohl CD4⁺CD69⁺ Effektor-T (Teff)-Zellen als auch CD4⁺CD44⁺CD62L-Effektor-Memory T (Tem)-Zellen zur Initiierung von EAE beitragen, wobei das Rezidivstadium wahrscheinlich von CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen dominiert wurde. Darüber hinaus sind in Bezug auf die Immunfunktion Helferzellen T (Th)1 hauptsächlich an der Initiierung der EAE beteiligt. Allerdings tragen sowohl Th1- als auch Th17-Zellen zum Schubstadium bei, und die immunsuppressive Funktion der regulatorischen T-Zellen (Treg) wurde während des EAE-pathologischen Prozesses gehemmt.

Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration des Zentralnervensystems (ZNS) mit Immunzellen und Demyelinisierung gekennzeichnet ist ^1,2. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass es sich um die häufigste Behinderungskrankheit bei jungen Menschen handelt, deren Inzidenz weltweit kontinuierlich zunimmt³. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein prototypisches Tiermodell für MS, das viele Aspekte der Entzündungsphase der menschlichen MS^{simuliert 4}. Aus Sicht der Immunfunktionen werden die initialen CD4-T-Zellen, die noch nicht auf Antigene gestoßen sind, als T(Th)-0-Helferzellen bezeichnet. Diese Zellen durchlaufen Reifungs- und Aktivierungsprozesse, um verschiedene Funktionen zu erfüllen. CD4-T-Zellen können nach ihren spezifischen Funktionen in mehrere Untergruppen eingeteilt werden, zu denen Th1, Th2, regulatorisches T (Treg), follikuläres Helfer-T (Tfh), Th17-, Th9- und Th22-Zellen gehören⁵. Es ist ein allgemeiner Konsens, dass die Zellsubtypen Th1 und Th17 entscheidende Pathogenesefaktoren von EAE⁶ sind. Th1-Zellen könnten Interferon γ (IFN-γ) sezernieren, und Th17-Zellen sezernieren Interleukin (IL)-17 und andere Entzündungsfaktoren, die andere Immunzellen wie Mikrogliazellen und Astrozyten aktivieren könnten. Diese Zellen produzieren entzündliche Zytokine⁷ wie IL-18, IL-12, IL-23 und IL-1β, die die Immunantwort der Th1/Th17-Zellen weiter induzieren könnten, was zu einer fortschreitenden Demyelinisierung und axonalen Schäden führt. Aus der Perspektive der Aktivierungsphase haben CD4-T-Zellen ein vorherbestimmtes Schicksal, sich zu unterschiedlichen Zelluntergruppen und differenzierten Zuständen zu entwickeln, einschließlich naiver, Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen⁸. Die anfänglichen CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Effektor-Untergruppen mit unterschiedlichen Funktionen in verschiedenen Umgebungen⁹. Die meisten Effektorzellen sind kurzlebig, wobei sich eine kleine Population von T-Zellen zu Gedächtnis-T-Zellen entwickelt, die bei der Wiederbegegnung mit denselben Antigenen schnelle Effektorfunktionen aufweisen und dem Wirt einen hochwirksamen und langfristigen Schutz bieten ^10,11.

Obwohl aktuelle Forschungsergebnisse darauf hindeuten, dass CD4-T-Zellen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von EAE spielen, ist noch unklar, wie verschiedene CD4-T-Zell-Untergruppen, klassifiziert nach ihrer Aktivierungsphase und Immunwirkungsfunktion, zur Initiierung und zum Rückfall von EAE beitragen. In der vorliegenden Studie etablierten wir das EAE-Modell in C57BL6/J-Mäusen durch Immunisierung des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG)35-55-Peptids und untersuchten die Initiierung und den Rückfall von EAE, wobei wir uns auf die Aktivierungsphase und die Immunfunktion von CD4-T-Zellen konzentrierten.

Protokoll

Insgesamt wurden für diese Studie 18 weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen nach dem Zufallsprinzip in eine Kontrollgruppe (n = 6) und eine EAE-Gruppe (n = 12) eingeteilt. Die Mäuse wurden vom Versuchstierzentrum der Ningxia Medical University gekauft. Die Mäuse wurden in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu frischem Wasser und Futter untergebracht. Die Ethikgenehmigung wurde vor Beginn der Studie von der Ethikkommission für Versuchstiere der Ningxia Medical University eingeholt.

1. Entwicklung einer schubförmig remittierenden EAE bei C57BL/6-Mäusen

1. Auflösung des Reagenzes
   1. 5,4 mg MOG35-55 (Materialtabelle) in 1,8 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen. Wiegen Sie 12,6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA (Materialtabelle) und geben Sie es in 1,8 ml vollständige Freund's Adjuvans (CFA) Lösung (Materialtabelle). Lösen Sie 360 μl Pertussis-Toxin (PTX; Tabelle der Materialien) mit einer Pipette in 7,2 ml PBS (Materialtabelle).
2. Vorbereitung der Emulsion von MOG35-55 und CFA
   1. MOG35-55-Lösung und CFA-Lösung mit zwei in Schritt 1.1 vorbereiteten 5-ml-Spritzen pipettieren und mit einem T-Ventil verbinden. 1 Stunde lang kontinuierlich auf Eis mischen, bis eine milchige Wasser-in-Öl-Emulsion entsteht.
      HINWEIS: Die Emulsion wird erfolgreich hergestellt, wenn sie auf der Wasseroberfläche schwimmt, ohne sich nach dem Tropfen ins Wasser zu dispergieren.
3. Anästhesierung von Mäusen
   1. Schrauben Sie die Füllverschlusskappe am vorderen Ende des Verdampfers des Anästhesiegeräts ab. Gießen Sie langsam 20 mL Isofluran entlang der Verschlussschraube in der Mitte und verriegeln Sie die Füllverschlusskappe. Schalten Sie den T-Ventil-Schalter, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesie-Induktionsbox kommuniziert wird (Materialtabelle).
   2. Schließen Sie das Netzteil der Luftpumpe an, schalten Sie den Schalter der Luftpumpe ein und drehen und stellen Sie das Luftquellenventil am vorderen Ende des Sauerstoffdurchflussmessers so ein, dass der Ausgangsgasfluss 400 ml/min beträgt. Öffnen Sie den Verdampfer, stellen Sie die Induktionskonzentration auf 3% ein und warten Sie, bis das Anästhetikum die Induktionsbox gefüllt hat.
   3. Etwa 1 Minute später legen Sie die Mäuse in die Induktionsbox, schließen Sie die Induktionsbox und warten Sie, bis sich die Mäuse im Tiefschlaf, Muskelentspannung und gleichmäßiger Atmung befinden. dann konnten die Mäuse als idealer Narkosezustand bestimmt werden (Table of Materials).
      HINWEIS: Schalten Sie den T-Ventil-Schalter, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesiemaske kommuniziert wird, bis die Mäuse vollständig betäubt sind.
4. Immunisierung von Mäusen
   1. Injizieren Sie subkutan 200 μl der in Schritt 1.2 hergestellten Emulsion mit einer 1-ml-Spritze mit der Nadel an vier Stellen auf dem Rücken der Maus, etwa 0,5 cm auf beiden Seiten der Wirbelsäule in der Achselhöhle und in der Leistenebene¹² bei den Mäusen der EAE-Gruppe. Verwenden Sie an jeder Stelle 50 μl Emulsion (Materialtabelle).
5. PTX-Einspritzung
   1. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Käfig, indem Sie den Schwanz fangen und auf den Käfigdraht legen. Halten Sie den Schwanz der Maus mit dem 4. und 5. Finger fest und ziehen Sie ihn sanft nach oben, um den Trend des Körpers und der Gliedmaßen nach vorne beizubehalten. Fassen Sie den Kopf der Mäuse und erfassen Sie die Haut auf dem Rücken der Mäuse mit dem Mittel- und Ringfinger.
   2. 0 h und 48 h nach der Immunisierung in Schritt 1.4 injizieren Sie 200 μl PTX intraperitoneal in einer Position von 0,5 cm entlang beider Seiten der Mittelabdominallinie mit einer Eindringtiefe von 1-2 cm mit einer 1-ml-Spritze mit Nadel (Materialtabelle).
      HINWEIS: Vor der Injektion von PTX 48 Stunden nach der Immunisierung von MOG35-55 ist es notwendig, Mäuse mit den in Schritt 1.3 beschriebenen Verfahren zu betäuben. Die Mäuse sollten so lange betreut werden, bis sie wieder genug Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
   3. Bei den Mäusen in der Kontrollgruppe wird die gleiche Methode mit Kochsalzlösung behandelt und der klinische Score täglich beurteilt.
      HINWEIS: Die Mäuse wurden nach folgender Skala auf Anzeichen von EAE untersucht:¹³: 0 = keine Krankheitssymptome, 1 = vollständige Lähmung des Schwanzes, 2 = partielle Lähmung/Schwäche der Hintergliedmaßen, 3 = vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen, 4 = Lähmung der vorderen und hinteren Gliedmaßen und 5 = moribunder Zustand.

2. Histologische Färbeanalyse

1. Sammlung des Gehirns
   1. Betäuben Sie die Mäuse nach Schritt 1.3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und öffnen Sie den Brustkorb, um das Herz vollständig freizulegen. Schneiden Sie die Auricula dextra und perfundieren Sie langsam mit einer vorgekühlten Kochsalzlösung mit einer 20-ml-Spritze mit Nadel am linken Ventrikel, bis die Leber grau und weiß wird.
   2. Perfundierte langsam mit 4% Paraformaldehyd, bis sich die Schwanzspitze nach oben dreht, der Körper steif wird und die Leber zäh wird. Kopf enthaupten, Schädel aufschneiden, Gehirn mit einer Pinzette einfangen und 24 h lang in 4%iger Paraformaldehydlösung fixieren (Materialtabelle).
2. Vorbereitung von Paraffinschnitten
   1. Gradientendehydratisierung: Tauchen Sie das Hirngewebe aus Schritt 2.1 nacheinander 1 h lang in 70 % Ethanol, 1 h lang 80 % Ethanol, 1 h lang 95 % Ethanol, 1 h lang wasserfreies Ethanol, ersetzen Sie es durch frisches wasserfreies Ethanol und tauchen Sie 1 h lang weiter (Materialtabelle).
   2. Transparenz: Tauchen Sie das Hirngewebe aus Schritt 2.2.1 für 30 Minuten in Xylol, ersetzen Sie es durch frisches Xylol und tauchen Sie es weiter ein, bis das Gewebe transparent ist (Materialtabelle).
   3. Einbetten: Hirngewebe aus Schritt 2.2.2 für 1 h in Paraffin einbetten, durch frisches Paraffin ersetzen, 1 h weiter einbetten, nach dem Lösen der Form in 6 μm große Scheiben schneiden, Objektträger in heißes Wasser legen, bei 37 °C trocknen, bei Raumtemperatur lagern (Materialtabelle).
   4. Entparaffinierung: Hirngewebe aus Schritt 2.2.3 20 min in Xylol tauchen, durch frisches Xylol ersetzen, 20 min weiter eintauchen, 5 min in wasserfreies Ethanol legen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min eintauchen, 5 min 75% Ethanol für 5 min, mit Leitungswasser abspülen (Materialtabelle).
   5. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung: Gewebe aus Schritt 2.2.4 3-5 min mit Hämatoxylinlösung färben und anschließend mit Leitungswasser abspülen. Behandeln Sie das Gewebe kurz mit einer Hämatoxylin-Differenzierungslösung und spülen Sie es gründlich mit Leitungswasser ab. Behandeln Sie das Gewebe mit Hämatoxylin, Scott Tap Bluing Solution, und spülen Sie es mit Leitungswasser ab. 5 min in 85 % Ethanol und 5 min in 95 % Ethanol eintauchen und 5 min mit Eosin-Farbstoff färben (Materialtabelle).
   6. Dehydrieren: Das Gewebe aus Schritt 2.2.5 nacheinander 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol tauchen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 Minuten weiter eintauchen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 Minuten eintauchen, 5 Minuten lang Xylol verwenden, durch frisches Xylol ersetzen, 5 Minuten eintauchen, mit neutralem Gummi versiegeln (Materialtabelle).
   7. Beobachten Sie das Hirngewebe mit einem Mikroskop und führen Sie Bildaufnahmen und -analysen durch (Materialtabelle).

3. Analyse der LFB-Färbung

1. Myelinscheidensammlung: Schneiden Sie die Wirbelsäule der Maus vom Kopfende 2 Segmente nach oben bis zum Schwanzende 2 Segmente nach unten, blasen Sie das Rückenmark bis zum Schwanzende aus und fixieren Sie das Rückenmark 24 Stunden lang in 4%iger Paraformaldehydlösung.
   HINWEIS: Die Myelinscheide wurde von denselben Mäusen in Schritt 2.1 entnommen, und die Schritte für die Herzperfusion sind die gleichen wie in 2.1.
2. Paraffinabschnitte Entparaffinisierung und Rehydratisierung: Die Objektträger aus Schritt 3.1 nacheinander für 20 min in Xylol legen, durch frisches Xylol ersetzen, 20 min weiter eintauchen, wasserfreies Ethanol 5 min, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min eintauchen, 5 min 75%iger Alkohol, mit Leitungswasser waschen.
3. Schnelle Blaufärbung: Luxol Fast Blaufärbung Lösung A in einen 60 °C Ofen geben und 30 Min. vorheizen. Legen Sie die Objektträger aus Schritt 3.2 in Lösung A und decken Sie sie 1 h lang mit einer Kunststofffolie ab, damit die Scheiben nicht austrocknen, nehmen Sie dann die Objektträger heraus und waschen Sie sie schnell mit Leitungswasser.
4. Unterscheidung des Hintergrunds: Legen Sie die Objektträger aus Schritt 3.3 für 2 s in die Luxol Fast Blue Staining Lösung B (während der Farbstoff heiß ist) und tauchen Sie sie direkt 15 s lang in die Luxol Fast Blue Staining Lösung C zur Differenzierung, waschen Sie sie mit Wasser, bis die Myelinscheide blau und der Hintergrund fast farblos ist.
5. Eosin-Gegenfärbung: Die Objektträger aus Schritt 3.4 zum Trocknen bei 65 °C in den Ofen schieben. Wenn sie fertig sind, nehmen Sie sie aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Legen Sie die Objektträger 1 Minute lang in 95%ige Ethanol- und Eosin-Gegenfärbung.
6. Dehydrierung und Versiegelung: Die Objektträger aus Schritt 3.5 nacheinander 5 min in wasserfreies Ethanol legen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min weiter eintauchen, wieder durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min weiter eintauchen, 5 min weiter eintauchen, 5 min xylol, durch frisches Xylol ersetzen, 5 min eintauchen. Waschen und trocknen Sie die Proben und versiegeln Sie sie mit neutralem Gummi.
7. Mikroskopische Untersuchung: Sammeln und analysieren Sie Bilder mit einem aufrechten optischen Mikroskop (Table of Materials).

4. Durchflusszytometrische Analyse

1. Öffnen Sie die Bauchhöhle von Mäusen. Die Milz mit einer Pinzette herausziehen und mit einer Schere auf Eis in kleine Stücke von 1,5-2,5 cm in PBS hacken. Mahlen Sie die Milz in 10 ml RPMI-1640 mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) mit einem 2,5-ml-Spritzenkolben und drücken Sie es durch ein 70-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten (Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Milz wurde von denselben Mäusen in Schritt 2.1 entnommen.
2. Die in Schritt 4.1 erhaltene Suspension wird in 15-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang mit 5 ml Lysionspuffer für rote Blutkörperchen auf Eis lysiert. Mit RPMI-1640 mit 2 % FBS waschen, 5 Minuten lang bei 350 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen mit RPMI-1640 mit 2 % FBS resuspendieren.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler (Table of Materials) und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
4. Pipettieren Sie 100 μl Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und inkubieren Sie 30 Minuten lang mit 1 μl Anti-Maus-CD16/32-Antikörper¹⁴ (0,5 mg/ml), um unspezifische Färbungen zu blockieren. Mit RPMI-1640 waschen und bei 350 x g 5 min zentrifugieren, den Überstand entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl RPMI-1640 mit 2 % FBS.
5. Färben Sie mit Antikörpern, die spezifisch für CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) und CD69 (BV674) sind, für Teff-Zellen¹⁵ für 30 min, 2 μl für jeden Antikörper. Färbung mit Antikörpern, die spezifisch für CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) und CD62L (PE) für Temzellen¹⁶ für 30 min sind, 2 μl für jeden Antikörper. Mit RPMI-1640 waschen und 5 min bei 350 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen in 350 μl PBS resuspendieren. Analysieren Sie den Zellanteil mit einem Durchflusszytometer und der zugehörigen Software (Table of Materials).

5. Analyse von Zytokinen mittels zytometrischem Bead-Array

1. Verwenden Sie das zytometrische Bead-Array (Materialtabelle), um IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, Tumornekrosefaktor (TNF)-α und IFN-γ in Mäusegehirnen zu messen, Methoden wie unten beschrieben.
2. Sammeln Sie das Gehirn der Maus, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
3. Extraktion des Gesamtproteins: 50 mg Hirngewebe schneiden und wiegen (drei Gehirne in der Kontrollgruppe, EAE-Gruppe im Spitzenstadium und RR-Stadium). Legen Sie das Gehirn in 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 500 μl Lysepuffer hinzu, der PMSF, Proteasehemmer und Phosphatasehemmer enthält.
4. Das Gehirn in kleine Stücke von ca. 1 mm³ schneiden, mit Ultraschall-Homogenisator bei 400 W, 5 s EIN und 5 s AUS extrahieren; 5x wiederholen. Stellen Sie das Röhrchen 10 min lang auf Eis, zentrifugieren Sie es 5 min lang bei 12000 x g und sammeln Sie den Überstand (Materialtabelle).
5. Bereiten Sie die Th1/Th2/Th17-Zytokinstandards der Maus wie unten beschrieben vor.
   1. Öffnen Sie ein Fläschchen mit lyophilisierten Maus-Th1/Th2/Th17-Standards. Übertragen Sie die Standards in ein konisches 15-ml-Polypropylen-Röhrchen. Beschriften Sie den Röhrendeckel standardmäßig.
   2. Rekonstituieren Sie die Standards in 2,0 ml Assay-Verdünnungsmittel. Lassen Sie den rekonstituierten Standard 15 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Mischen Sie das rekonstituierte Protein vorsichtig durch Pipettieren.
   3. Beschriften Sie 12 mm x 75 mm Röhrchen und ordnen Sie sie in der folgenden Verdünnungsreihenfolge an: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256. Pipettieren Sie 300 μl Assay-Verdünnungsmittel in jedes markierte Röhrchen.
   4. Führen Sie serielle Verdünnungen durch: Übertragen Sie 300 μl des Top-Standards in das 1:2-Verdünnungsröhrchen und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung fort, indem Sie 300 μl aus dem 1:2-Röhrchen in das 1:4-Röhrchen usw. bis zum 1:256-Röhrchen übertragen. Bereiten Sie ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen vor, das nur das Assay-Verdünnungsmittel enthält, das als 0 pg/ml-Negativkontrolle dienen soll.
      HINWEIS: Durch Pipettieren gründlich mischen. Nicht wirbeln, um zu verhindern, dass die Antikörperkopplung an den Mikrokügelchen abfällt.
   5. Um die Th1/Th2/Th17-Zytokin-Fangkügelchen der Maus zu mischen, bereiten Sie 19 Röhrchen vor, einschließlich Standards mit 3 Proben in jeder Gruppe (Kontrollgruppe, EAE-Gruppe im Spitzenstadium und RR-Stadium) für das Experiment. Die Auffangraupensuspension vor dem Mischen 5 s lang kräftig vortexen. Geben Sie 190 μl jeder Fangperle in ein einzelnes Röhrchen und beschriften Sie es als gemischte Fangperlen. Die Perlenmischung gründlich einreiben.
      HINWEIS: Die antikörperkonjugierten Kügelchen setzen sich mit der Zeit aus der Suspension ab. Es ist notwendig, das Fläschchen vor der Entnahme eines Perlsuspensionsaliquots zu wirbeln.
   6. Um den Assay durchzuführen, wirbeln Sie die Mix-Capture-Kügelchen vortexen. Geben Sie 50 μl Kügelchen in alle Analyseröhrchen. 50 μl Maus-Th1/Th2/Th17-Zytokin-Standardverdünnungen werden in die Kontrollröhrchen gegeben, wie in Tabelle 1 angegeben.
   7. Geben Sie 50 μl des Maus-Nachweisreagenzes Th1/Th2/Th17 PE in alle Analyseröhrchen. Inkubieren Sie die Analyseröhrchen 2 h lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht. Geben Sie 1 mL Waschpuffer in jedes Analyseröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 x g . Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus jedem Analyseröhrchen.
   8. Geben Sie 300 μl Waschpuffer in jedes Analyseröhrchen, um das Bead-Pellet wieder zu resuspendieren. Analysieren Sie Th1/Th2/Th17-Zytokindaten der Maus mit der FCAP Array-Software (Table of Materials).

  

Ergebnisse

Bewertung der klinischen Ergebnisse
Wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigten die Mäuse in der Kontrollgruppe keine klinischen Symptome. Die Mäuse in der EAE-Gruppe, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, zeigten etwa 12 Tage nach der Immunisierung eine Schwanzlähmung. Am 16. Tag erreichten die Symptome eine vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen (definiert als Spitzenstadium, Peak). Danach ließen die Symptome allmählich nach. Die k...

Diskussion

MS ist die häufigste demyelinisierende Autoimmunerkrankung des ZNS, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind¹⁷. Die EAE ist das typische Tiermodell zur Simulation der klinischen pathologischen Merkmale von MS¹⁸. Studien haben gezeigt, dass Menschen mit MS aufgrund der Degeneration von Axonen und Neuronen im ZNS kognitive Beeinträchtigungen und andere Behinderungen erleiden 19,20,21.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine evaporator	Norvap	20-17368
Isoflurane	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	792632
70 μm cell strainer	XIYAN Co.,Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103128
APC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100616
Automatic cell counter	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Complete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	SLCH4887
Dehydrator	DIAPATH	Donatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)	Yikang Group	210820
Dyeing machine	DIAPATH	Giotto
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Fetal Bovine Serum	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Glass slide	Servicebio	G6004
HE dye solution set	Servicebio	G1003
Hematoxylin-Eosin solution	Servicebio	G1002
High speed refrigerated centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Imaging system	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kit	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Neutral gum	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Oven	Labotery	GFL-230
Pathology slicer	Leica	RM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Pipette 0.5-10 μL	DLAB Scientific	7010101004
Pipette 100-1000 μL	DLAB Scientific	7010101014
Pipette 20-200 μL	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	PM150110
Tee valve	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd	KD-P
Upright optical microscope	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xylene	SCRC	10023418