JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נעשה שימוש במודל ניסיוני של דלקת מוח אוטואימונית (EAE) בעכברים כדי לחקור את תפקידם של תאי CD4 T בהתחלה ובהישנות של EAE מנקודת המבט של שלב ההפעלה ותפקוד ההשפעה החיסונית.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בחדירה של תאי חיסון ודמיאלינציה במערכת העצבים המרכזית (CNS). דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE) משמשת כמודל אב-טיפוס של בעלי חיים לחקר טרשת נפוצה. במחקר זה, מטרתנו הייתה לחקור את תפקידם של תאי CD4 T בהתחלה והישנות של EAE, תוך התמקדות בשלב ההפעלה והתגובה החיסונית. כדי ליצור את מודל עכברי EAE, עכברים נקבות חוסנו במיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG)35-55 מתחלב עם אדג'ובנט פרוינד שלם (CFA). הציונים הקליניים הוערכו מדי יום, והתוצאות הראו כי עכברים בקבוצת EAE הפגינו דפוס התקפי-הפוגתי קלאסי. ניתוח צביעה של המטוקסילין-אאוזין (H&E) וכחול מהיר לוקסול (LFB) חשף חדירה משמעותית של תאים דלקתיים במערכת העצבים המרכזית ודמיאלינציה בעכברי EAE. לגבי שלב ההפעלה, גם תאי אפקטור CD4+CD69+ T (Teff) וגם תאי זיכרון אפקטור CD4+CD44+CD62L (Tem) עשויים לתרום להתחלת EAE, עם זאת, שלב ההישנות נשלט ככל הנראה על ידי תאי CD4+CD44+CD62L-Tem. נוסף על כך, מבחינת תפקוד מערכת החיסון, תאי T (Th)1 מסייעים מעורבים בעיקר בהתחלת ה-EAE. עם זאת, גם תאי Th1 וגם Th17 תורמים לשלב ההישנות והתפקוד המדכא את מערכת החיסון של תאי T רגולטוריים (Treg) עוכב במהלך התהליך הפתולוגי של EAE.

Introduction

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בחדירה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם תאים חיסוניים ודמיאלינציה 1,2. מחקר שנערך לאחרונה הראה שזו המחלה הנכה הנפוצה ביותר הפוגעת באנשים צעירים, כאשר שכיחותה עולה בהתמדה ברחבי העולם3. דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעלי חיים אב-טיפוסי לטרשת נפוצה המדמה היבטים רבים של השלב הדלקתי של טרשת נפוצה אנושית4. מנקודת המבט של תפקודי מערכת החיסון, תאי CD4 T הראשוניים שעדיין לא נתקלו באנטיגנים מכונים תאי T(Th) 0 מסייעים. תאים אלה עוברים תהליכי התבגרות והפעלה כדי להציג פונקציות שונות. ניתן לסווג תאי CD4 T למספר תת-קבוצות בהתאם לתפקידיהם הספציפיים, הכוללים תאי Th1, Th2, T רגולטורי (Treg), תאי עזר זקיקים T (Tfh), Th17, Th9 ו-Th225. קיים קונצנזוס נפוץ כי תת-סוגים של תאי Th1 ו-Th17 הם גורמי פתוגנזה מכריעים של EAE6. תאי Th1 יכולים להפריש אינטרפרון γ (IFN-γ), ותאי Th17 מפרישים אינטרלוקין (IL)-17 וגורמים דלקתיים אחרים, שיכולים להפעיל תאים חיסוניים אחרים כמו תאי מיקרוגליה ואסטרוציטים. תאים אלה מייצרים ציטוקינים דלקתיים7, כגון IL-18, IL-12, IL-23 ו-IL-1β, שעלולים לגרום לתגובה החיסונית של תאי Th1/Th17, וכתוצאה מכך לדמיאלינציה מתקדמת ולנזק אקסונלי. מנקודת המבט של שלב ההפעלה, לתאי CD4 T יש גורל קבוע מראש להתפתח לתת-קבוצות תאים נפרדות ולמצבים מובחנים, כולל תאי T נאיביים, אפקטורים וזיכרון8. תאי ה-CD4 T הראשוניים מתרבים ומתמיינים למגוון תת-קבוצות אפקטורים עם פונקציות שונות בסביבות שונות9. רוב תאי האפקטור הם קצרי מועד, כאשר אוכלוסייה קטנה של תאי T מתפתחת לתאי T זיכרון המציגים תפקודי אפקטור מהירים כאשר הם נתקלים מחדש באותם אנטיגנים ומספקים למארח הגנה חזקה וארוכת טווח10,11.

למרות שהמחקר הנוכחי מצביע על כך שתאי CD4 T ממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות EAE, עדיין לא ברור כיצד תת-קבוצות שונות של תאי CD4 T, המסווגות על סמך שלב ההפעלה ותפקוד ההשפעה החיסונית שלהן, תורמות להתחלה והישנות של EAE. במחקר הנוכחי, ביססנו את מודל ה-EAE בעכברי C57BL6/J על ידי חיסון מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG)35-55 פפטיד וחקרנו את ההתחלה וההישנות של EAE, תוך התמקדות בשלב ההפעלה והתפקוד החיסוני של תאי CD4 T.

Protocol

בסך הכל 18 עכברי C57BL/6J נקבות בגילאי שישה עד שמונה שבועות חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת (n = 6) וקבוצת EAE (n = 12) למחקר זה. עכברים נרכשו ממרכז חיות הניסוי של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה. העכברים שוכנו בחדר מבוקר טמפרטורה ולחות עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, וגישה חופשית למים מתוקים ולמזון. אישור האתיקה התקבל מוועדת האתיקה של חיות ניסוי של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה לפני תחילת המחקר.

1. התפתחות EAE הפוגתי התקפי בעכברי C57BL/6

  1. פירוק ריאגנטים
    1. ממיסים 5.4 מ"ג MOG35-55 (טבלת חומרים) ב-1.8 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). שקלו 12.6 מ"ג Mycobacterium tuberculosis H37RA (טבלת החומרים) והוסיפו אותו ל-1.8 מ"ל של תמיסת אדג'ובנט מלאה של פרוינד (CFA) (טבלת החומרים). ממיסים 360 מיקרוליטר של רעלן שעלת (PTX; טבלת חומרים) ל-7.2 מ"ל PBS באמצעות פיפטה (טבלת חומרים).
  2. הכנת תחליב של MOG35-55 ו-CFA
    1. תמיסת פיפטה MOG35-55 ותמיסת CFA באמצעות שני מזרקים של 5 מ"ל שהוכנו בשלב 1.1 ומחברים אותם עם שסתום טי. מערבבים ברציפות על קרח למשך שעה אחת עד לקבלת תחליב מים חלבי בשמן.
      הערה: האמולסיה מוכנה בהצלחה כאשר היא צפה על פני המים מבלי להתפזר לאחר הפלתה למים.
  3. הרדמת עכבר
    1. הברג את מכסה אטם המילוי בקצה הקדמי של מאייד מכונת ההרדמה. יוצקים לאט 20 מ"ל איזופלורן לאורך בורג האיטום במרכז ונועלים את מכסה אטם המילוי. החלף את מתג שסתום הטי כדי להבטיח שזרימת האוויר ממאייד מכונת ההרדמה מועברת עם תיבת האינדוקציה של ההרדמה (טבלת חומרים).
    2. חבר את ספק הכוח של משאבת האוויר, הפעל את מתג משאבת האוויר וסובב והתאם את שסתום מקור האוויר בקצה הקדמי של מד זרימת החמצן כך שזרימת גז המוצא תהיה 400 מ"ל/דקה. פתח את המאייד, כוונן את ריכוז האינדוקציה ל -3%, והמתן עד שחומר ההרדמה ימלא את תיבת האינדוקציה.
    3. כדקה לאחר מכן, הכניסו את העכברים לקופסת האינדוקציה, ואז סגרו את קופסת האינדוקציה, והמתינו עד שהעכברים יהיו בשינה עמוקה, הרפיית שרירים ונשימה יציבה; לאחר מכן, ניתן לקבוע את העכברים כמצב ההרדמה האידיאלי (טבלת חומרים).
      הערה: החלף את מתג שסתום הטי כדי להבטיח שזרימת האוויר מהמאייד של מכונת ההרדמה מועברת עם מסכת ההרדמה עד שהעכברים מורדמים לחלוטין.
  4. חיסון עכברים
    1. הזרקה תת עורית של 200 מיקרוליטר של תחליב שהוכן בשלב 1.2 באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם המחט בארבעה אתרים בגב העכבר, כ-0.5 ס"מ משני צידי עמוד השדרה בבית השחי ובמישור המפשעה12 בעכברים מקבוצת EAE. השתמש ב-50 מיקרוליטר של תחליב בכל אתר (טבלת חומרים).
  5. הזרקת PTX
    1. הוציאו את העכברים מהכלוב על ידי תפיסת הזנב והניחו אותו על חוט הכלוב. החזק את זנב העכברים עם האצבעות הרביעית והחמישית ומשוך אותו בעדינות כלפי מעלה כדי לשמור על מגמת הגוף והגפיים קדימה. תפסו את ראשם של העכברים ותפסו את העור בגב העכברים בעזרת האצבע האמצעית והקמיצה.
    2. לאחר 0 שעות ו-48 שעות לאחר החיסון בשלב 1.4, יש להזריק 200 מיקרוליטר של PTX תוך צפקי במיקום של 0.5 ס"מ משני צידי קו הבטן האמצעית עם עומק חדירה של 1-2 ס"מ באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם מחט (טבלת חומרים).
      הערה: לפני הזרקת PTX לאחר 48 שעות לאחר החיסון של MOG35-55, יש צורך להרדים עכברים באמצעות ההליכים המתוארים בשלב 1.3. יש לטפל בעכברים עד שהם יחזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה.
    3. עבור העכברים בקבוצת הביקורת, יש לטפל במי מלח באותה שיטה ולהעריך את הציון הקליני מדי יום.
      הערה: עכברים הוערכו לסימנים של EAE על פי הסולם הבא13: 0 = ללא תסמיני מחלה, 1 = שיתוק מוחלט של הזנב, 2 = שיתוק/חולשה אחורית חלקית, 3 = שיתוק מלא של הגפה האחורית, 4 = שיתוק גפיים קדמיות ואחוריות, ו-5 = מצב גוסס.

2. ניתוח צביעה היסטולוגית

  1. איסוף מוחות
    1. הרדמו את העכברים לפי שלב 1.3. המתת חסד של העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם ופתח את בית החזה כדי לחשוף את הלב במלואו. חותכים את האפרכסת ומחלחלים לאט עם תמיסת מלח מקוררת מראש באמצעות מזרק של 20 מ"ל עם מחט בחדר השמאלי עד שהכבד הופך לאפור ולבן.
    2. לחלחל לאט עם 4% פרפורמלדהיד עד שקצה הזנב מופיע, הגוף הופך נוקשה והכבד הופך קשה. ערפו את ראשו של הראש, חתכו את הגולגולת, אספו את המוח באמצעות פינצטה וקבעו אותו בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות (טבלת חומרים).
  2. הכנת קטעי פרפין
    1. התייבשות שיפוע: טבלו את רקמות המוח משלב 2.1 ברציפות ב-70% אתנול למשך שעה, 80% אתנול למשך שעה, 95% אתנול למשך שעה, אתנול נטול מים למשך שעה, החליפו באתנול נטול מים טרי, המשיכו לטבול למשך שעה אחת (טבלת החומרים).
    2. שקיפות: טבלו את רקמות המוח משלב 2.2.1 בקסילן למשך 30 דקות, החליפו אותן בקסילן טרי והמשיכו לטבול עד שהרקמות שקופות (טבלת החומרים).
    3. הטמעה: הטמיעו את רקמות המוח משלב 2.2.2 בפרפין למשך שעה, החליפו בפרפין טרי, המשיכו להטמיע למשך שעה, חתכו לפרוסות של 6 מיקרומטר לאחר שחרור העובש, הניחו את השקופית במים חמים, יבשו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, אחסנו בטמפרטורת החדר (טבלת החומרים).
    4. הסרת שעווה: טבלו רקמות מוח משלב 2.2.3 בקסילן למשך 20 דקות, החליפו בקסילן טרי, המשיכו לטבול במשך 20 דקות, הניחו באתנול נטול מים למשך 5 דקות, החליפו באתנול נטול מים טרי, טבלו למשך 5 דקות, 75% אתנול למשך 5 דקות, שטפו במי ברז (טבלת החומרים).
    5. צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E): יש לצבוע רקמות משלב 2.2.4 בתמיסת המטוקסילין למשך 3-5 דקות ולאחר מכן לשטוף במי ברז. טפלו ברקמות בתמיסת התמיינות המטוקסילין, בקצרה ושטפו היטב במי ברז. יש לטפל ברקמות הנייר עם תמיסת הכחולה של המטוקסילין סקוט ולשטוף במי ברז. טבלו ב-85% אתנול למשך 5 דקות ו-95% אתנול למשך 5 דקות, והכתים את השלבים בצבע אאוזין למשך 5 דקות (טבלת חומרים).
    6. לייבש: לטבול רקמות משלב 2.2.5 ברציפות באתנול נטול מים למשך 5 דקות, להחליף באתנול נטול מים טרי, להמשיך לטבול במשך 5 דקות, להחליף באתנול נטול מים טרי, לטבול למשך 5 דקות, קסילן למשך 5 דקות, להחליף בקסילן טרי, לטבול למשך 5 דקות, לאטום עם מסטיק ניטרלי (טבלת חומרים).
    7. התבוננו באמצעות מיקרוסקופ ברקמות המוח ובצעו רכישה וניתוח של תמונות (טבלת חומרים).

3. ניתוח צביעת LFB

  1. איסוף נדן מיאלין: חותכים את עמוד השדרה של העכברים ממסוף הראש למעלה 2 מקטעים למסוף הזנב למטה 2 מקטעים, מפוצצים את חוט השדרה למסוף הזנב ומקבעים את חוט השדרה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות.
    הערה: מעטפת המיאלין נקצרה מאותם עכברים בשלב 2.1, והשלבים לזלוף הלב זהים לשלב 2.1.
  2. קטעי פרפין דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים: הכניסו את השקופיות משלב 3.1 ברציפות לקסילן למשך 20 דקות, החליפו בקסילן טרי, המשיכו לטבול במשך 20 דקות, אתנול נטול מים למשך 5 דקות, החליפו באתנול נטול מים טרי, טבלו למשך 5 דקות, 75% אלכוהול למשך 5 דקות, שטפו במי ברז.
  3. צביעה כחולה מהירה: מניחים תמיסת צביעה כחולה מהירה לוקסול A בתנור 60 מעלות צלזיוס ומחממים מראש למשך 30 דקות. הכניסו את השקופיות משלב 3.2 לתמיסה A וכסו אותן בקרום פלסטיק למשך שעה כדי למנוע התייבשות של פרוסות, ואז הוציאו את השקופיות ושטפו אותן במהירות במי ברז.
  4. בידול רקע: הכניסו את השקופיות משלב 3.3 לתמיסת צביעה כחולה מהירה לוקסול B למשך 2 שניות (כשהצבע חם), וטבלו ישירות בתמיסת צביעה כחולה מהירה לוקסול C להתמיינות למשך 15 שניות, שטפו במים עד שמעטפת המיאלין כחולה והרקע כמעט חסר צבע.
  5. מכתים נגדיים של Eosin: הכניסו את השקופיות משלב 3.4 לתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס לייבוש. לאחר שתסיים, הוציאו אותם מהתנור והניחו להם להתקרר. הכניסו את השקופיות לצביעה נגדית של 95% אתנול ואאוזין למשך דקה.
  6. התייבשות ואיטום: הכניסו את השקופיות משלב 3.5 ברציפות לאתנול נטול מים 5 דקות, החליפו באתנול נטול מים טרי, המשיכו לטבול במשך 5 דקות, החליפו שוב באתנול נטול מים טרי, המשיכו לטבול במשך 5 דקות, קסילן 5 דקות, החליפו בקסילן טרי, טבלו למשך 5 דקות. שוטפים ומייבשים את הדגימות ואוטמים אותן במסטיק ניטרלי.
  7. בדיקת מיקרוסקופ: איסוף וניתוח תמונות באמצעות מיקרוסקופ אופטי זקוף (טבלת חומרים).

4. ניתוח ציטומטריית זרימה

  1. פתח את חלל הבטן של עכברים. מחלצים את הטחול בעזרת פינצטה וטוחנים לחתיכות קטנות של 1.5-2.5 ס"מ ב- PBS על קרח בעזרת מספריים. טוחנים את הטחול ב-10 מ"ל של RPMI-1640 המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) באמצעות בוכנת מזרק של 2.5 מ"ל ודוחפים אותו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לקבלת תרחיף תא יחיד (טבלת חומרים).
    הערה: הטחול נקצר מאותם עכברים בשלב 2.1.
  2. העבירו את התרחיף שהתקבל בשלב 4.1 לצינורות של 15 מ"ל וליזה באמצעות 5 מ"ל של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות על קרח למשך 10 דקות. שטפו עם RPMI-1640 המכיל 2% FBS, צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים עם RPMI-1640 המכיל 2% FBS.
  3. ספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי (טבלת חומרים) והתאם את הריכוז ל-1 x 106 תאים/מ"ל.
  4. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך צינורות של 1.5 מ"ל ודגירה עם 1 מיקרוליטר של נוגדן CD16/32 נגד עכבר14 (0.5 מ"ג/מ"ל) למשך 30 דקות כדי לחסום צביעה לא ספציפית. שוטפים עם RPMI-1640 וצנטריפוגה ב -350 x גרם למשך 5 דקות, זורקים את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של RPMI-1640 המכילים 2% FBS.
  5. צביעה עם נוגדנים ספציפיים ל-CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) ו-CD69 (BV674) לתאי טף15 למשך 30 דקות, 2 מיקרוליטר לכל נוגדן. צביעה עם נוגדנים ספציפיים ל-CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) ו-CD62L (PE) עבור תאי Tem16 למשך 30 דקות, 2 מיקרוליטר לכל נוגדן. שטפו עם RPMI-1640 וצנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-350 מיקרוליטר של PBS. נתח את פרופורציות התאים באמצעות ציטומטר זרימה והתוכנה הנלווית (טבלת חומרים).

5. אנליזה של ציטוקינים על ידי מערך חרוזים ציטומטרי

  1. השתמש במערך החרוזים הציטומטרי (טבלת החומרים) כדי למדוד IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, גורם נמק גידול (TNF)-α ו-IFN-γ במוחות עכברים, שיטות כמתואר להלן.
  2. אסוף מוח עכבר כמתואר בשלב 2.1.
  3. מיצוי חלבון כולל: חותכים ושוקלים 50 מ"ג רקמת מוח (שלושה מוחות בקבוצת הביקורת, קבוצת EAE בשלב השיא ושלב RR). הנח מוחות בצינורות של 1.5 מ"ל והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל PMSF, מעכב פרוטאז ומעכבי פוספטאז.
  4. חותכים מוחות לחתיכות קטנות בסביבות 1 מ"מ3, מחלצים על ידי הומוגנייזר קולי ב -400 וואט, 5 שניות מופעל ו -5 שניות כבוי; חזור על הפעולה למשך 5x. הניחו את הצינור על קרח למשך 10 דקות, צנטריפוגה בטמפרטורה של 12000 x גרם למשך 5 דקות, ואספו את הסופרנטנט (טבלת חומרים).
  5. הכן תקני ציטוקינים Th1/Th2/Th17 של עכבר כמתואר להלן.
    1. פתח בקבוקון של תקני עכבר ליופיליזציה Th1/Th2/Th17. העבירו את התקנים לצינור פוליפרופילן חרוטי בנפח 15 מ"ל. סמן את החלק העליון של הצינור כסטנדרט.
    2. להרכיב מחדש את התקנים ב-2.0 מ"ל של מדלל בדיקה. אפשר לתקן המחודש להתייצב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות את החלבון המחודש על ידי פיפטינג.
    3. סמן צינורות בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ וסדר אותם בסדר הדילול הבא: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 ו-1:256. פיפטה 300 מיקרוליטר של מדלל בדיקה בכל שפופרת מסומנת.
    4. בצע דילולים סדרתיים: העבר 300 מיקרוליטר מהסטנדרט העליון לצינור הדילול 1:2 וערבב היטב על ידי פיפטינג. המשך בדילול סדרתי על ידי העברת 300 מיקרוליטר מצינור 1:2 לצינור 1:4 וכן הלאה עד לצינור 1:256. הכן צינור בגודל 12 מ"מ על 75 מ"מ המכיל רק את מדלל הבדיקה כדי לשמש כבקרה שלילית של 0 pg/mL.
      הערה: מערבבים היטב על ידי פיפטינג. אין מערבולת כדי למנוע את נפילת צימוד הנוגדנים על המיקרו-חרוזים.
    5. כדי לערבב את חרוזי לכידת הציטוקינים Th1/Th2/Th17 של העכבר, הכינו 19 צינורות, כולל תקנים עם 3 דגימות בכל קבוצה (קבוצת ביקורת, קבוצת EAE בשלב השיא ושלב RR) לניסוי. מערבולת את מתלה חרוז הלכידה במרץ במשך 5 שניות לפני הערבוב. הוסף 190 מיקרוליטר מכל חרוז לכידה לתוך צינור יחיד ותייג אותו כחרוזי לכידה מעורבים. מערבל היטב את תערובת החרוזים.
      הערה: החרוזים המצומדים בנוגדנים ישקעו מהתרחיף עם הזמן. יש צורך לסובב את הבקבוקון לפני נטילת תרחיף חרוזים.
    6. כדי לבצע את הבדיקה, מערבול את חרוזי לכידת המיקס. הוסף 50 מיקרוליטר חרוזים לכל צינורות הבדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר של דילולים סטנדרטיים של ציטוקינים Th1/Th2/Th17 של עכבר לצינורות הבקרה כמו בטבלה 1.
    7. הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב זיהוי PE Th1/Th2/Th17 של העכבר לכל צינורות הבדיקה. דגרו על צינורות הבדיקה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר והגנו עליהם מפני אור. הוסף 1 מ"ל של מאגר כביסה לכל צינור בדיקה וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות. שאפו והשליכו את הסופרנטנט מכל צינור בדיקה בזהירות.
    8. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל צינור בדיקה כדי להשעות מחדש את גלולת החרוזים. נתח נתוני ציטוקינים Th1/Th2/Th17 של עכבר באמצעות תוכנת FCAP Array (טבלת חומרים).

  

תוצאות

הערכת ציונים קליניים
כפי שמוצג באיור 1, העכברים בקבוצת הביקורת לא הראו תסמינים קליניים כלשהם. העכברים בקבוצת EAE, שחוסנו ב-MOG35-55, הראו שיתוק זנב כ-12 ימים לאחר החיסון. ביום ה-16, התסמינים הגיעו לשיתוק מוחלט של הגפיים האחוריות (מוגדר כשלב שיא, שיא). לאח?...

Discussion

טרשת נפוצה היא המחלה האוטואימונית הנפוצה ביותר של מערכת העצבים המרכזית, המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם17. EAE הוא מודל בעלי חיים טיפוסי להדמיית המאפיינים הפתולוגיים הקליניים של MS18. מחקרים הראו כי אנשים עם טרשת נפוצה חווים ליקוי קוגניטיבי ו?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של נינגשיה (2022AAC03601 ו-2023AAC02087) וקרן המחקר של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה (XM2019052). תודה על התמיכה של מרכז המחקר למדע וטכנולוגיה רפואית של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machine evaporatorNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.792632
70 μm cell strainerXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103128
APC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100616
Automatic cell counterJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 AntibodyBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction KitShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. SLCH4887
DehydratorDIAPATHDonatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)Yikang Group210820
Dyeing machineDIAPATHGiotto
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EthanolSCRC100092683
Fetal Bovine SerumProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Glass slideServicebioG6004
HE dye solution setServicebioG1003
Hematoxylin-Eosin solutionServicebioG1002
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Imaging systemNikonNIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kitServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Neutral gumSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Pathology slicerLeicaRM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Pipette 0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
Pipette 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
Pipette 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.PM150110
Tee valveGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Tissue spreaderZhejiang Kehua Instrument Co.,LtdKD-P
Upright optical microscopeNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418

References

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888 (2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156 (2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357 (2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204 (2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390 (2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60 (2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508 (2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573 (2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280 (2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239 (2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173 (2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411 (2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

T CD4MOG35 55TTTTh1Th17T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved