CD4 T 细胞在复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

摘要

采用小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 模型，从激活期和免疫效应功能的角度研究 CD4 T 细胞在 EAE 初始和复发中的作用。

摘要

多发性硬化症 （MS） 是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润和中枢神经系统 （CNS） 脱髓鞘。实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是研究 MS 的原型动物模型。在这项研究中，我们旨在研究 CD4 T 细胞在 EAE 启动和复发中的作用，重点关注激活期和免疫反应。为了创建 EAE 小鼠模型，用完全弗氏佐剂 （CFA） 乳化的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 （MOG）35-55 对雌性小鼠进行免疫。每天评估临床评分，结果表明 EAE 组小鼠表现出经典的复发缓解模式。苏木精-伊红 （H&E） 和 luxol 固蓝 （LFB） 染色分析显示 EAE 小鼠中 CNS 中炎细胞显着浸润和脱髓鞘。关于激活期，CD4⁺CD69⁺效应T（Teff）细胞和CD4⁺CD44⁺CD62L^-效应记忆T（Tem）细胞都可能有助于EAE的启动，然而，复发阶段可能以CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem细胞为主。此外，在免疫功能方面，辅助性 T （Th）1 细胞主要参与启动 EAE。然而，Th1 和 Th17 细胞都有助于复发阶段，并且在 EAE 病理过程中调节性 T （Treg） 细胞的免疫抑制功能受到抑制。

引言

多发性硬化症 （MS） 是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润中枢神经系统 （CNS） 并脱髓鞘 ^1,2。最近的一项研究表明，它是影响年轻人的最常见致残性疾病，其发病率在全球范围内持续增加³。实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是一种 MS 原型动物模型，可模拟人类 MS⁴ 炎症期的许多方面。从免疫功能的角度来看，初始尚未遇到抗原的 CD4 T 细胞称为辅助性 T（Th） 0 细胞。这些细胞经历成熟和激活过程以表现出各种功能。CD4 T 细胞根据其特定功能可分为几个亚群，包括 Th1、Th2、调节性 T （Treg）、滤泡辅助性 T （Tfh）、Th17、Th9 和 Th22 细胞⁵。Th1 和 Th17 细胞亚型是 EAE⁶ 的关键发病机制因素，这是一个普遍的共识。Th1 细胞可以分泌干扰素γ （IFN-γ），Th17 细胞分泌白细胞介素 （IL）-17 和其他炎症因子，这些因子可以激活其他免疫细胞，如小胶质细胞和星形胶质细胞。这些细胞产生炎性细胞因子⁷，如 IL-18、IL-12、IL-23 和 IL-1β，可进一步诱导 Th1/Th17 细胞的免疫反应，导致进行性脱髓鞘和轴突损伤。从激活期的角度来看，CD4 T 细胞具有发育成不同细胞亚群和分化状态的预定命运，包括幼稚 T 细胞、效应 T 细胞和记忆 T 细胞⁸。初始 CD4 T 细胞在不同环境中增殖并分化为具有不同功能的各种效应子亚群⁹。大多数效应细胞是短暂的，少量 T 细胞发育成记忆 T 细胞，当再次遇到相同的抗原时，这些细胞表现出快速的效应功能，并为宿主提供高效和长期的保护^10,11。

尽管目前的研究表明 CD4 T 细胞在 EAE 的发展中起着重要作用，但目前尚不清楚根据其激活期和免疫效应功能分类的不同 CD4 T 细胞亚群如何促进 EAE 的发生和复发。在本研究中，我们通过免疫髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 （MOG）35-55 肽在 C57BL6/J 小鼠中建立了 EAE 模型，并研究了 EAE 的发生和复发，重点关注 CD4 T 细胞的活化期和免疫功能。

研究方案

在本研究中，共有 18 只 6 至 8 周龄的雌性 C57BL/6J 小鼠被随机分为对照组 （n = 6） 和 EAE 组 （n = 12）。小鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。将小鼠饲养在温度和湿度受控的房间中，光照/黑暗循环 12 小时，可自由获得淡水和食物。在研究开始前已获得宁夏医科大学实验动物伦理委员会的伦理批准。

1. C57BL/6 小鼠复发缓解型 EAE 的开发

1. 试剂溶解
   1. 将 5.4 mg MOG35-55（材料表）溶解在 1.8 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中。称取 12.6 mg 结核分枝杆菌 H37RA（材料表）并将其加入 1.8 mL 完整的弗氏佐剂 （CFA） 溶液（材料表）中。溶解 360 μL 百日咳毒素 （PTX; 材料表）使用移液管加入 7.2 mL 的 PBS 中（材料表）。
2. MOG35-55 和 CFA 乳液的制备
   1. 使用步骤 1.1 中准备的两个 5 mL 注射器移液 MOG35-55 溶液和 CFA 溶液，并将它们与三通阀连接。在冰上连续混合 1 小时，直到获得乳白色的油包水乳液。
      注：当乳液漂浮在水面上时，乳剂制备成功，滴入水中后不会分散。
3. 小鼠麻醉
   1. 拧下麻醉机蒸发器前端的填充密封盖。沿中心的密封螺钉缓慢倒入 20 mL 异氟醚，并锁紧填充密封盖。切换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流与麻醉诱导箱相通（材料表）。
   2. 接通气泵电源，打开气泵开关，旋转调节氧气流量计前端的气源阀，使输出气体流量为 400 mL/min。打开蒸发器，将诱导浓度调节至 3%，等待麻醉剂充满诱导箱。
   3. 大约 1 min 后，将小鼠放入诱导箱中，然后关闭诱导箱，等待小鼠处于深度睡眠、肌肉放松和呼吸平稳的状态;然后，可以确定小鼠为理想的麻醉状态（材料表）。
      注意：切换三通阀开关，确保来自麻醉机蒸发器的气流与麻醉面罩相通，直到小鼠完全麻醉。
4. 小鼠免疫
   1. 使用 1 mL 注射器皮下注射步骤 1.2 中制备的 200 μL 乳剂，针头位于小鼠背部的四个部位，在 EAE 组小鼠的腋窝和腹股沟平面¹² 的脊柱两侧约 0.5 cm。在每个位置使用 50 μL 乳剂（材料表）。
5. PTX 注入
   1. 抓住尾巴将老鼠从笼子里拉出来，放在笼子的铁丝上。用第 4 个和第 5 个手指握住鼠标的尾巴，轻轻向上拉，以保持身体和四肢向前的趋势。抓住小鼠的头部，用中指和无名指捕捉小鼠背部的皮肤。
   2. 在步骤 1.4 免疫后 0 小时和 48 小时，使用 1 mL 带针头的注射器沿腹腔线两侧 0.5 cm 的位置腹膜内注射 200 μL PTX，穿透深度为 1-2 cm（材料表）。
      注意：在 MOG35-55 免疫后 48 小时注射 PTX 之前，有必要使用步骤 1.3 中描述的程序麻醉小鼠。应照顾小鼠，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
   3. 对于对照组的小鼠，使用相同的方法用生理盐水处理并每天评估临床评分。
      注意：根据以下等级¹³ 评估小鼠的 EAE 迹象：0 = 无疾病症状，1 = 尾巴完全瘫痪，2 = 部分后肢麻痹/无力，3 = 完全后肢麻痹，4 = 前肢和后肢麻痹，5 = 垂死状态。

2. 组织学染色分析

1. 大脑收集
   1. 按照步骤 1.3 麻醉小鼠。通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并打开胸部以完全暴露心脏。切开耳廓，用 20 mL 注射器在左心室带针头，用预冷的盐水溶液缓慢灌注，直到肝脏变成灰白色。
   2. 用 4% 多聚甲醛缓慢灌注，直到尾尖翘起，身体变得僵硬，肝脏变得坚韧。斩首头部，切开头骨，用镊子收集大脑，并将其固定在 4% 多聚甲醛溶液中 24 小时（材料表）。
2. 石蜡切片的制备
   1. 梯度脱水：将步骤 2.1 中的脑组织连续浸入 70% 乙醇中 1 小时，80% 乙醇中 1 小时，95% 乙醇中 1 小时，无水乙醇 1 小时，用新鲜的无水乙醇替换，继续浸泡 1 小时（材料表）。
   2. 透明度：将步骤 2.2.1 中的脑组织浸入二甲苯中 30 分钟，用新鲜的二甲苯替换它们，然后继续浸入直到组织透明（材料表）。
   3. 包埋：将步骤 2.2.2 中的脑组织包埋在石蜡中 1 小时，用新鲜石蜡替换，继续包埋 1 小时，脱模后切成 6 μm 切片，将载玻片放入热水中，在 37 °C 下干燥，在室温下储存（材料表）。
   4. 脱蜡：将步骤 2.2.3 中的脑组织浸入二甲苯中 20 分钟，更换为新鲜的二甲苯，继续浸泡 20 分钟，置于无水乙醇中 5 分钟，更换为新鲜的无水乙醇，浸泡 5 分钟，75% 乙醇 5 分钟，用自来水冲洗（材料表）。
   5. 苏木精-伊红 （H&E） 染色：用苏木精溶液对步骤 2.2.4 中的组织染色 3-5 分钟，然后用自来水冲洗。用苏木精分化溶液处理组织，短暂并用自来水彻底冲洗。用苏木精 Scott 水龙头发蓝溶液处理组织，然后用自来水冲洗。浸入 85% 乙醇中 5 分钟，在 95% 乙醇中浸泡 5 分钟，然后用伊红染料染色 5 分钟（材料表）。
   6. 脱水：将步骤 2.2.5 中的组织连续浸入无水乙醇中 5 分钟，更换为新鲜的无水乙醇，继续浸泡 5 分钟，更换为新鲜的无水乙醇，浸泡 5 分钟，二甲苯更换为新鲜的二甲苯，浸泡 5 分钟，用中性胶密封（材料表）。
   7. 使用显微镜观察脑组织并进行图像采集和分析（材料表）。

3. LFB 染色分析

1. 髓鞘采集：将小鼠脊柱从头端向上 2 节到尾端向下 2 节，将脊髓吹出至尾端，将脊髓在 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h。
   注：在步骤 2.1 中从相同的小鼠中收获髓鞘，心脏灌注的步骤与 2.1 中相同。
2. 石蜡切片脱蜡再水化：将步骤 3.1 的玻片依次放入二甲苯中 20 分钟，更换新鲜二甲苯，继续浸泡 20 分钟，无水乙醇 5 分钟，更换新鲜无水乙醇，浸泡 5 分钟，75% 酒精 5 分钟，用自来水洗涤。
3. 快速蓝色染色：将 luxol 快速蓝色染色溶液 A 置于 60 °C 的烘箱中并预热 30 分钟。将步骤 3.2 中的载玻片放入溶液 A 中，并用塑料膜覆盖 1 小时以防止切片变干，然后取出载玻片并用自来水快速清洗。
4. 背景鉴别：将步骤 3.3 的载玻片放入 luxol 固蓝染色液 B 中 2 s（染料热时），直接浸入 luxol 固蓝染色液 C 中分化 15 s，用水洗涤至髓鞘呈蓝色，背景几乎无色。
5. 曙红反染：将步骤 3.4 中的载玻片放入 65 °C 的烘箱中干燥。完成后，将它们从烤箱中取出并让它们冷却。将载玻片放入 95% 乙醇和伊红复染中 1 分钟。
6. 脱水和密封：将步骤 3.5 中的载玻片依次放入无水乙醇中 5 分钟，更换为新鲜的无水乙醇，继续浸泡 5 分钟，再次更换为新鲜的无水乙醇，继续浸泡 5 分钟，二甲苯 5 分钟，更换为新鲜的二甲苯，浸泡 5 分钟。清洗并干燥样品，并用中性胶密封。
7. 显微镜检查：使用正置光学显微镜收集和分析图像（材料表）。

4. 流式细胞术分析

1. 打开小鼠的腹腔。用镊子提取脾脏，用剪刀在冰上的 PBS 中切成 1.5-2.5 厘米的小块。使用 2.5 mL 注射器活塞在 10 mL 含有 2% 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI-1640 中研磨脾脏，并将其推入 70 μm 细胞过滤器以获得单细胞悬液（材料表）。
   注意：在步骤 2.1 中，从相同的小鼠中收获脾脏。
2. 将步骤 4.1 中获得的悬浮液转移到 15 mL 试管中，并在冰上使用 5 mL 红细胞裂解缓冲液裂解 10 分钟。用含有 2% FBS 的 RPMI-1640 洗涤，以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用含有 2% FBS 的 RPMI-1640 重悬细胞。
3. 使用自动细胞计数器（材料表）计数细胞，并将浓度调节至 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
4. 将 100 μL 细胞悬液移液到 1.5 mL 试管中，并与 1 μL 抗小鼠 CD16/32 抗体¹⁴ （0.5 mg/mL） 一起孵育 30 分钟，以阻断非特异性染色。用 RPMI-1640 洗涤并以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 100 μL 含有 2% FBS 的 RPMI-1640 中。
5. 用 Teff 细胞¹⁵ 的 CD45 （Alexa Fluor 700）、CD3 （FITC）、CD4 （APC） 和 CD69 （BV674） 特异性抗体染色 30 分钟，每种抗体 2 μL。用 Tem 细胞¹⁶ 的 CD45 （Alexa Fluor 700）、CD3 （FITC）、CD4 （APC）、CD44 （BV421） 和 CD62L （PE） 特异性抗体染色 30 分钟，每种抗体 2 μL。用 RPMI-1640 洗涤并以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液并将细胞重悬于 350 μL PBS 中。使用流式细胞仪和相关软件分析细胞比例（材料表）。

5. 通过流式微球阵列分析细胞因子

1. 使用细胞计数珠阵列（材料表）测量小鼠大脑中的 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子 （TNF）-α 和 IFN-γ，方法如下所述。
2. 如步骤 2.1 中所述收集小鼠大脑。
3. 总蛋白提取：切块称取 50 mg 脑组织（对照组 3 个脑，巅峰期 EAE 组和 RR 期）。将大脑放入 1.5 mL 试管中，加入 500 μL 含有 PMSF、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液。
4. 将大脑切成约 1 mm³ 的小块，通过超声波匀浆器以 400 W、5 s ON 和 5 s OFF 提取;重复 5 次。将试管置于冰上 10 分钟，以 12000 x g 离心 5 分钟，并收集上清液（材料表）。
5. 如下所述制备小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子标准品。
   1. 打开一小瓶冻干小鼠 Th1/Th2/Th17 标准品。将标准品转移至 15 mL 锥形聚丙烯管中。将管顶标记为标准。
   2. 在 2.0 mL 分析稀释剂中复溶标准品。让重组的标准品在室温下平衡 15 分钟。通过移液轻轻混合重构的蛋白质。
   3. 标记 12 mm x 75 mm 试管，并按以下稀释顺序排列：1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128 和 1：256。在每个标记的试管中吸取 300 μL 检测稀释剂。
   4. 进行连续稀释：将 300 μL 顶级标准品转移到 1：2 稀释管中，并通过移液充分混合。继续连续稀释，将 300 μL 从 1：2 试管转移到 1：4 试管中，以此类推，直到 1：256 试管。制备一个 12 mm x 75 mm 的试管，其中仅包含检测稀释剂，用作 0 pg/mL 阴性对照。
      注意：通过移液充分混合。请勿涡旋，以防止微珠上的抗体偶联脱落。
   5. 为了混合小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子捕获珠，准备 19 管，包括每组 3 个样品的标准品（对照组、处于峰值阶段的 EAE 组和 RR 阶段）用于实验。混合前，将捕获珠悬浮液剧烈涡旋 5 秒。将 190 μL 每种捕获珠加入单管中，并将其标记为混合捕获珠。彻底涡旋珠子混合物。
      注：抗体偶联的微珠会随着时间的推移从悬浮液中沉淀出来。在取微珠悬浮等分试样之前，有必要涡旋样品瓶。
   6. 为了进行检测，涡旋混合物捕获珠。向所有检测管中加入 50 μL 珠子。如 表 1 所示，向对照管中加入 50 μL 小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子标准稀释液。
   7. 向所有检测管中加入 50 μL 小鼠 Th1/Th2/Th17 PE 检测试剂。将检测管在室温下孵育 2 小时，并避光保存。向每个检测管中加入 1 mL 洗涤缓冲液，并以 200 x g 离心 5 分钟。小心地从每个检测管中吸出并丢弃上清液。
   8. 向每个检测管中加入 300 μL 洗涤缓冲液以重悬微珠沉淀。使用 FCAP Array 软件分析小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子数据（材料表）。

  

结果

临床评分评估
如图 1 所示，对照组的小鼠没有表现出任何临床症状。用 MOG35-55 免疫的 EAE 组小鼠在免疫后约 12 天表现出尾部麻痹。到第 16 天，症状达到完全性后肢麻痹 （定义为高峰期，Peak）。之后，症状逐渐缓解。小鼠的临床症状在 25 天左右加重，并在大约 30 天达到完全后肢麻痹 （定义为复发期，RR）。值得注意的是，症状持续...

讨论

MS 是 CNS 最普遍的自身免疫性脱髓鞘疾病，影响着全球数百万人¹⁷。EAE 是模拟 MS¹⁸ 临床病理特征的典型动物模型。研究表明，由于 CNS 轴突和神经元的退化，MS 患者会出现认知障碍和其他残疾 19,20,21。在 EAE 模型的高峰期和 RR 期，小鼠的尾巴和后肢表现出麻痹。此外?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine evaporator	Norvap	20-17368
Isoflurane	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	792632
70 μm cell strainer	XIYAN Co.,Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103128
APC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100616
Automatic cell counter	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Complete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	SLCH4887
Dehydrator	DIAPATH	Donatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)	Yikang Group	210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)	Yikang Group	210820
Dyeing machine	DIAPATH	Giotto
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Fetal Bovine Serum	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Glass slide	Servicebio	G6004
HE dye solution set	Servicebio	G1003
Hematoxylin-Eosin solution	Servicebio	G1002
High speed refrigerated centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Imaging system	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kit	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Neutral gum	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Oven	Labotery	GFL-230
Pathology slicer	Leica	RM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Pipette 0.5-10 μL	DLAB Scientific	7010101004
Pipette 100-1000 μL	DLAB Scientific	7010101014
Pipette 20-200 μL	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	PM150110
Tee valve	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd	KD-P
Upright optical microscope	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xylene	SCRC	10023418