JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se empleó un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) en ratones para investigar el papel de las células T CD4 en la introducción y recaída de EAE desde la perspectiva de la fase de activación y la función del efecto inmune.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la infiltración de células inmunitarias y la desmielinización en el sistema nervioso central (SNC). La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal prototípico para el estudio de la EM. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar el papel de los linfocitos T CD4 en el inicio y la recaída de la EAE, centrándonos en la fase de activación y la respuesta inmunitaria. Para crear el modelo de ratones EAE, se inmunizaron ratones hembra con glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)35-55 emulsionada con adyuvante de Freund completo (CFA). Las puntuaciones clínicas se evaluaron diariamente y los resultados demostraron que los ratones del grupo EAE presentaban un patrón clásico de recaída-remisión. El análisis de tinción de hematoxilina-eosina (H&E) y luxol fast blue (LFB) reveló una infiltración significativa de células inflamatorias en el SNC y desmielinización en ratones EAE. En cuanto a la fase de activación, tanto los linfocitos T efectores CD4+CD69+ como los linfocitos T (Tem) efectores CD4+CD44+CD62L- pueden contribuir al inicio de la EAE, sin embargo, la etapa de recaída probablemente estuvo dominada por los linfocitos Tem CD4+CD44+CD62L- . Además, en términos de función inmunitaria, las células T (Th)1 colaboradoras están principalmente implicadas en el inicio de la EAE. Sin embargo, tanto las células Th1 como las Th17 contribuyen a la etapa de recaída, y la función inmunosupresora de las células T reguladoras (Treg) se inhibió durante el proceso patológico de EAE.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) y la desmielinización 1,2. Un estudio reciente ha demostrado que es la enfermedad discapacitante más común que afecta a los jóvenes, con una incidencia en continuo aumento en todo el mundo3. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal prototípico de EM que simula muchos aspectos de la fase inflamatoria de la EM humana4. Desde el punto de vista de las funciones inmunitarias, las células T CD4 iniciales que aún no han encontrado antígenos se denominan células T(Th) 0 auxiliares. Estas células se someten a procesos de maduración y activación para exhibir diversas funciones. Las células T CD4 se pueden clasificar en varios subconjuntos según sus funciones específicas, que incluyen células Th1, Th2, T reguladoras (Treg), T auxiliares foliculares (Tfh), Th17, Th9 y Th225. Es un consenso común que los subtipos de células Th1 y Th17 son factores de patogénesis cruciales de EAE6. Las células Th1 podrían secretar interferón γ (IFN-γ), y las células Th17 secretan interleucina (IL)-17 y otros factores inflamatorios, que podrían activar otras células inmunitarias como las células microgliales y los astrocitos. Estas células producen citocinas inflamatorias7, como IL-18, IL-12, IL-23 e IL-1β, que podrían inducir aún más la respuesta inmunitaria de las células Th1/Th17, lo que resulta en una desmielinización progresiva y daño axonal. Desde la perspectiva de la fase de activación, las células T CD4 poseen un destino predeterminado para desarrollarse en distintos subconjuntos celulares y estados diferenciados, incluidos los linfocitos T naïve, efector y de memoria8. Las células T CD4 iniciales proliferan y se diferencian en una variedad de subconjuntos efectores con diferentes funciones en diferentes ambientes9. La mayoría de las células efectoras son de vida corta, con una pequeña población de células T que se convierten en células T de memoria que exhiben funciones efectoras rápidas cuando se vuelven a encontrar con los mismos antígenos y proporcionan al huésped una protección altamente potente y a largo plazo10,11.

Aunque la investigación actual sugiere que las células T CD4 desempeñan un papel importante en el desarrollo de la EAE, todavía no está claro cómo los diferentes subconjuntos de células T CD4, clasificados en función de su fase de activación y función de efecto inmunitario, contribuyen al inicio y la recaída de la EAE. En el presente estudio, establecimos el modelo EAE en ratones C57BL6/J mediante la inmunización del péptido 35-55 de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) e investigamos el inicio y la recaída de EAE, centrándonos en la fase de activación y la función inmune de las células T CD4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Un total de 18 ratones hembra C57BL/6J de entre seis y ocho semanas de edad se dividieron aleatoriamente en un grupo de control (n = 6) y un grupo EAE (n = 12) para este estudio. Los ratones se compraron en el centro de animales de experimentación de la Universidad Médica de Ningxia. Los ratones se alojaron en una habitación con temperatura y humedad controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y libre acceso a agua dulce y alimentos. Se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Ningxia antes de que comenzara el estudio.

1. Desarrollo de EAE remitente recurrente en ratones C57BL/6

  1. Disolución de reactivos
    1. Disuelva 5,4 mg de MOG35-55 (Tabla de materiales) en 1,8 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pesar 12,6 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Tabla de Materiales) y añadirlo a 1,8 mL de solución completa de adyuvante de Freund (CFA) (Tabla de Materiales). Disuelve 360 μL de toxina pertussis (PTX; Tabla de Materiales) en 7,2 mL de PBS utilizando una pipeta (Tabla de Materiales).
  2. Preparación de la emulsión de MOG35-55 y CFA
    1. Pipetee la solución MOG35-55 y la solución CFA utilizando dos jeringas de 5 mL preparadas en el paso 1.1 y conéctelas con una válvula en T. Mezclar continuamente en hielo durante 1 h hasta obtener una emulsión lechosa de agua en aceite.
      NOTA: La emulsión se prepara con éxito cuando está flotando en la superficie del agua sin dispersarse después de dejarla caer en el agua.
  3. Anestesia del ratón
    1. Desenrosque la tapa del sello de llenado en el extremo delantero del evaporador de la máquina de anestesia. Vierta lentamente 20 ml de isoflurano a lo largo del tornillo de sellado en el centro y bloquee la tapa del sello de llenado. Cambie el interruptor de la válvula en T para asegurarse de que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia se comunique con la caja de inducción de anestesia (Tabla de materiales).
    2. Conecte la fuente de alimentación de la bomba de aire, encienda el interruptor de la bomba de aire y gire y ajuste la válvula de la fuente de aire en el extremo delantero del medidor de flujo de oxígeno para que el flujo de gas de salida sea de 400 mL / min. Abra el evaporador, ajuste la concentración de inducción al 3% y espere a que el anestésico llene la caja de inducción.
    3. Aproximadamente 1 minuto después, coloque a los ratones en la caja de inducción, luego cierre la caja de inducción y espere a que los ratones estén en sueño profundo, relajación muscular y respiración constante; luego, se pudo determinar a los ratones como el estado ideal de anestesia (Tabla de Materiales).
      NOTA: Cambie el interruptor de la válvula en T para asegurarse de que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia se comunique con la máscara de anestesia hasta que los ratones estén completamente anestesiados.
  4. Inmunización con ratones
    1. Inyectar por vía subcutánea 200 μL de emulsión preparada en el paso 1.2 con una jeringa de 1 mL con la aguja en cuatro puntos del dorso del ratón, a unos 0,5 cm a ambos lados de la columna vertebral en el plano de la axila e ingle12 en los ratones del grupo EAE. Utilice 50 μL de emulsión en cada sitio (Tabla de Materiales).
  5. Inyección PTX
    1. Saca a los ratones de la jaula atrapando la cola y colócala en el alambre de la jaula. Sostenga la cola de los ratones con los dedos 4º y 5º y tire suavemente hacia arriba para mantener la tendencia del cuerpo y las extremidades hacia adelante. Agarra la cabeza de los ratones y captura la piel de la parte posterior de los ratones con los dedos medio y anular.
    2. A las 0 h y 48 h después de la inmunización en el paso 1.4, inyecte 200 μl de PTX por vía intraperitoneal a una posición de 0,5 cm a lo largo de cada lado de la línea abdominal media con una profundidad de penetración de 1-2 cm utilizando una jeringa de 1 ml con aguja (tabla de materiales).
      NOTA: Antes de inyectar PTX a las 48 h después de la inmunización de MOG35-55, es necesario anestesiar a los ratones utilizando los procedimientos descritos en el paso 1.3. Los ratones deben ser atendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
    3. En el caso de los ratones del grupo de control, se debe tratar con solución salina utilizando el mismo método y evaluar la puntuación clínica diariamente.
      NOTA: Los ratones fueron evaluados para detectar signos de EAE de acuerdo con la siguiente escala13: 0 = sin síntomas de enfermedad, 1 = parálisis completa de la cola, 2 = parálisis/debilidad parcial de la parte posterior, 3 = parálisis completa de las extremidades posteriores, 4 = parálisis de las extremidades delanteras y traseras, y 5 = estado moribundo.

2. Análisis histológico de la tinción

  1. Colección de cerebros
    1. Anestesiar a los ratones siguiendo el paso 1.3. Sacrificar a los ratones por dislocación cervical y abrir el tórax para exponer el corazón por completo. Cortar la aurícula y perfundirla lentamente con una solución salina preenfriada utilizando una jeringa de 20 ml con aguja en el ventrículo izquierdo hasta que el hígado se vuelva gris y blanco.
    2. Perfundir lentamente con paraformaldehído al 4% hasta que la punta de la cola se levante, el cuerpo se vuelva rígido y el hígado se endurezca. Decapitar la cabeza, cortar el cráneo, recoger el cerebro con pinzas y fijarlo en solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h (Tabla de Materiales).
  2. Preparación de secciones de parafina
    1. Deshidratación en gradiente: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.1 sucesivamente en etanol al 70% durante 1 h, etanol al 80% durante 1 h, etanol al 95% durante 1 h, etanol anhidro durante 1 h, reemplácelo con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 1 h (Tabla de materiales).
    2. Transparencia: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.2.1 en xileno durante 30 minutos, reemplácelos con xileno fresco y continúe sumergiendo hasta que los tejidos estén transparentes (Tabla de materiales).
    3. Incrustación: Incrustar los tejidos cerebrales del paso 2.2.2 en parafina durante 1 h, sustituirlos por parafina fresca, continuar incrustando durante 1 h, cortar en rodajas de 6 μm después de la liberación del molde, colocar el portaobjetos en agua caliente, secar a 37 °C, almacenar a temperatura ambiente (Tabla de materiales).
    4. Desparafinado: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.2.3 en xileno durante 20 minutos, reemplácelos con xileno fresco, continúe sumergiendo durante 20 minutos, colóquelos en etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, sumérjalos durante 5 minutos, etanol al 75% durante 5 minutos, enjuague con agua del grifo (Tabla de materiales).
    5. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E): Teñir los tejidos del paso 2.2.4 con una solución de hematoxilina durante 3-5 minutos y luego enjuagar con agua del grifo. Tratar los tejidos con una solución de diferenciación de hematoxilina, brevemente y enjuagar abundantemente con agua del grifo. Trate los tejidos con hematoxilina Scott solución azulada para grifos y enjuague con agua del grifo. Sumergir en etanol al 85% durante 5 min y en etanol al 95% durante 5 min, y teñir los pasos con tinte de eosina durante 5 min (Tabla de Materiales).
    6. Deshidratar: Sumerja los tejidos del paso 2.2.5 sucesivamente en etanol anhidro durante 5 min, reemplácelos con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 5 min, reemplace con etanol anhidro fresco, sumerja durante 5 min, xileno durante 5 min, reemplace con xileno fresco, sumerja durante 5 min, selle con goma neutra (Tabla de materiales).
    7. Observar con un microscopio los tejidos cerebrales y realizar la adquisición y el análisis de imágenes (Tabla de Materiales).

3. Análisis de tinción de LFB

  1. Recolección de la vaina de mielina: Corte la columna vertebral de los ratones desde el terminal de la cabeza hasta 2 segmentos hasta el terminal de la cola 2 segmentos, sople la médula espinal hasta el terminal de la cola y fije la médula espinal en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h.
    NOTA: La vaina de mielina se extrajo de los mismos ratones en el paso 2.1, y los pasos para la perfusión cardíaca son los mismos que en 2.1.
  2. Desparafinación y rehidratación de los trozos de parafina: Coloque los portaobjetos del paso 3.1 sucesivamente en xileno durante 20 minutos, reemplácelos con xileno fresco, continúe sumergiendo durante 20 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, sumerja durante 5 minutos, alcohol al 75% durante 5 minutos, lave con agua del grifo.
  3. Tinción azul rápida: Coloque la solución de tinción azul rápida A de luxol en un horno a 60 °C y precaliente durante 30 min. Coloque los portaobjetos del paso 3.2 en la solución A y cúbralos con una membrana de plástico durante 1 h para evitar que las rodajas se sequen, luego saque los portaobjetos y lávelos rápidamente con agua del grifo.
  4. Diferenciación de fondo: Coloque los portaobjetos del paso 3.3 en la solución de tinción azul rápida de luxol B durante 2 s (mientras el tinte está caliente) y sumérjalos directamente en la solución de tinción azul rápida de luxol C para la diferenciación durante 15 s, lave con agua hasta que la vaina de mielina esté azul y el fondo esté casi incoloro.
  5. Contratinción de eosina: Coloque los portaobjetos del paso 3.4 en el horno a 65 °C para su secado. Una vez hechos, retíralos del horno y déjalos enfriar. Coloque los portaobjetos en una contratinción de etanol y eosina al 95% durante 1 min.
  6. Deshidratación y sellado: Coloque los portaobjetos del paso 3.5 sucesivamente en etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco nuevamente, continúe sumergiendo durante 5 minutos, xileno 5 minutos, reemplácelos con xileno fresco, sumerja durante 5 minutos. Lavar y secar las muestras y sellarlas con goma neutra.
  7. Examen microscópico: Recolectar y analizar imágenes usando un microscopio óptico vertical (Tabla de Materiales).

4. Análisis de citometría de flujo

  1. Abre la cavidad abdominal de los ratones. Extraiga el bazo con unas pinzas y pique en trozos pequeños de 1,5-2,5 cm en PBS sobre hielo con unas tijeras. Muela el bazo en 10 mL de RPMI-1640 que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) usando un pistón de jeringa de 2.5 mL y empújelo a través de un filtro de celdas de 70 μm para obtener una suspensión de una sola celda (Tabla de materiales).
    NOTA: Los bazos se extrajeron de los mismos ratones en el paso 2.1.
  2. Transfiera la suspensión obtenida en el paso 4.1 a tubos de 15 mL y lise usando 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos en hielo durante 10 min. Lavar con RPMI-1640 que contiene 2% de FBS, centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con RPMI-1640 que contiene 2% de FBS.
  3. Cuente las celdas con un contador automático de celdas (Tabla de materiales) y ajuste la concentración a 1 x 106 celdas/mL.
  4. Pipetear 100 μL de suspensión celular en tubos de 1,5 mL e incubar con 1 μL de anticuerpo anti-ratón CD16/3214 (0,5 mg/mL) durante 30 min para bloquear la tinción inespecífica. Lavar con RPMI-1640 y centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 μL de RPMI-1640 que contienen 2% de FBS.
  5. Tinción con anticuerpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) y CD69 (BV674) para células Teff15 durante 30 min, 2 μL para cada anticuerpo. Tinción con anticuerpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) y CD62L (PE) para células madre16 durante 30 min, 2 μL para cada anticuerpo. Lavar con RPMI-1640 y centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 350 μL de PBS. Analice la proporción de celdas utilizando un citómetro de flujo y el software asociado (Tabla de materiales).

5. Análisis de citoquinas por matriz de perlas citométricas

  1. Utilice la matriz de perlas citométricas (Tabla de materiales) para medir IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IFN-γ en cerebros de ratones, métodos como se describe a continuación.
  2. Recoja el cerebro del ratón como se describe en el paso 2.1.
  3. Extracción de proteína total: Cortar y pesar 50 mg de tejido cerebral (tres cerebros en el grupo control, grupo EAE en la etapa pico y etapa RR). Coloque los cerebros en tubos de 1,5 ml y agregue 500 μl de tampón de lisis que contiene PMSF, inhibidor de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa.
  4. Cortar los sesos en trozos pequeños de alrededor de 1 mm3, extraer mediante homogeneizador ultrasónico a 400 W, 5 s ON y 5 s OFF; Repita por 5 veces. Coloque el tubo en hielo durante 10 min, centrifugue a 12000 x g durante 5 min, y recoja el sobrenadante (Tabla de Materiales).
  5. Prepare los patrones de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón como se describe a continuación.
    1. Abra un vial de ratón liofilizado con patrones Th1/Th2/Th17. Transfiera los patrones a un tubo cónico de polipropileno de 15 mL. Etiquete la parte superior del tubo como estándar.
    2. Reconstituya los patrones en 2,0 mL de diluyente de ensayo. Deje que el patrón reconstituido se equilibre durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mezcle suavemente la proteína reconstituida mediante pipeteo.
    3. Etiquete los tubos de 12 mm x 75 mm y colóquelos en el siguiente orden de dilución: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 y 1:256. Pipetear 300 μL de diluyente de ensayo en cada tubo marcado.
    4. Realizar diluciones en serie: Transfiera 300 μL del estándar superior al tubo de dilución 1:2 y mezcle bien mediante pipeteo. Continúe las diluciones en serie transfiriendo 300 μL del tubo 1:2 al tubo 1:4 y así sucesivamente hasta el tubo 1:256. Prepare un tubo de 12 mm x 75 mm que contenga solo el diluyente del ensayo para que sirva como control negativo de 0 pg/mL.
      NOTA: Mezcle bien pipeteando. No haga vórtice para evitar que el acoplamiento de anticuerpos en las microperlas se caiga.
    5. Para mezclar las perlas de captura de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón, prepare 19 tubos, incluidos los estándares, con 3 muestras en cada grupo (grupo de control, grupo EAE en etapa pico y etapa RR) para el experimento. Agite la suspensión de la cuenta de captura vigorosamente durante 5 s antes de mezclar. Agregue 190 μL de cada perla de captura en un solo tubo y etiquételo como perlas de captura mixtas. Agita bien la mezcla de cuentas.
      NOTA: Las perlas conjugadas con anticuerpos se asentarán fuera de la suspensión con el tiempo. Es necesario vórtice el vial antes de tomar una alícuota de suspensión de perlas.
    6. Para realizar el ensayo, haga un vórtice de las perlas de captura de la mezcla. Añada 50 μL de perlas a todos los tubos de ensayo. Añadir 50 μL de diluciones estándar de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón a los tubos de control como se muestra en la Tabla 1.
    7. Añada 50 μL del reactivo de detección de PE Th1/Th2/Th17 de ratón a todos los tubos de ensayo. Incubar los tubos de ensayo durante 2 h a temperatura ambiente y protegerlos de la luz. Añada 1 ml de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugue a 200 x g durante 5 min. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo de ensayo.
    8. Añada 300 μl de tampón de lavado a cada tubo de ensayo para volver a suspender el gránulo de perlas. Analice los datos de citocinas Th1/Th2/Th17 del ratón utilizando el software FCAP Array (Tabla de materiales).

  

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Evaluación de las puntuaciones clínicas
Como se muestra en la Figura 1, los ratones del grupo control no mostraron ningún síntoma clínico. Los ratones del grupo EAE, que fueron inmunizados con MOG35-55, mostraron parálisis de la cola aproximadamente 12 días después de la inmunización. Para el día 16, los síntomas alcanzaron la parálisis completa de las extremidades traseras (definida como etapa máxima, Peak). Después de eso,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

La EM es la enfermedad desmielinizante autoinmune más prevalente del SNC, que afecta a millones de personas en todo el mundo17. EAE es el modelo animal típico para simular las características clínico-patológicas de la EM18. Los estudios han demostrado que las personas con EM experimentan deterioro cognitivo y otras discapacidades debido a la degeneración de los axones y las neuronas en el SNC 19,20,21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Ningxia (2022AAC03601 y 2023AAC02087) y la Fundación de Investigación de la Universidad Médica de Ningxia (XM2019052). Gracias por el apoyo del Centro de Investigación de Ciencia y Tecnología Médica de la Universidad Médica de Ningxia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machine evaporatorNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.792632
70 μm cell strainerXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103128
APC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100616
Automatic cell counterJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 AntibodyBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction KitShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. SLCH4887
DehydratorDIAPATHDonatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)Yikang Group210820
Dyeing machineDIAPATHGiotto
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EthanolSCRC100092683
Fetal Bovine SerumProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Glass slideServicebioG6004
HE dye solution setServicebioG1003
Hematoxylin-Eosin solutionServicebioG1002
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Imaging systemNikonNIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kitServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Neutral gumSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Pathology slicerLeicaRM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Pipette 0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
Pipette 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
Pipette 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.PM150110
Tee valveGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Tissue spreaderZhejiang Kehua Instrument Co.,LtdKD-P
Upright optical microscopeNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418

Referencias

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

C lulas T CD4Encefalomielitis Autoinmune ExperimentalEsclerosis M ltipleRespuesta InmunitariaGlicoprote na de Oligodendrocitos de MielinaMOG35 55Adyuvante de Freund CompletoC lulas InflamatoriasDesmielinizaci nC lulas T efectorasC lulas T de memoriaC lulas T colaboradorasC lulas Th1C lulas Th17C lulas T reguladoras

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados