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要約

マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを使用して、活性化段階と免疫効果機能の観点から、EAEの初期および再発におけるCD4T細胞の役割を調査しました。

要約

多発性硬化症(MS)は、免疫細胞の浸潤と中枢神経系(CNS)での脱髄を特徴とする自己免疫疾患です。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、多発性硬化症を研究するためのプロトタイプ動物モデルとして機能します。本研究では、CD4 T細胞がEAEの開始と再発に関与する役割について、活性化期と免疫応答に着目して検討することを目指しました。EAEマウスモデルを作成するために、雌マウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化して免疫しました。臨床スコアは毎日評価され、その結果、EAEグループのマウスは古典的な再発寛解パターンを示したことが示されました。ヘマトキシリン-エオシン(H&E)およびルキソールファストブルー(LFB)染色分析により、中枢神経系の炎症細胞の有意な浸潤とEAEマウスの脱髄が明らかになりました。活性化期については、CD4+CD69+エフェクターT(Teff)細胞とCD4+CD44+CD62L-エフェクターメモリーT(Tem)細胞の両方がEAEの開始に寄与している可能性があるが、再発期はCD4+CD44+CD62L-Tem細胞が優勢であった可能性が高い。さらに、免疫機能に関しては、ヘルパーT(Th)1細胞が主にEAEの開始に関与しています。しかし、Th1細胞とTh17細胞の両方が再発期に寄与し、EAEの病理学的過程では制御性T(Treg)細胞の免疫抑制機能が阻害されました。

概要

多発性硬化症(MS)は、免疫細胞による中枢神経系(CNS)の浸潤と脱髄を特徴とする自己免疫疾患です1,2。最近の研究では、若者が罹患する最も一般的な障害疾患であり、その発生率は世界中で継続的に増加していることが示されています3。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、ヒト MS4 の炎症期の多くの側面をシミュレートする MS のプロトタイプ動物モデルです。免疫機能の観点から、まだ抗原に遭遇していない最初のCD4 T細胞はヘルパーT(Th)0細胞と呼ばれます。これらの細胞は、成熟と活性化の過程を経て、さまざまな機能を発揮します。CD4 T細胞は、その特定の機能に応じて、Th1、Th2、制御性T(Treg)、濾胞ヘルパーT(Tfh)、Th17、Th9、およびTh22細胞5を含む、いくつかのサブセットに分類することができる。Th1およびTh17細胞サブタイプがEAE6の重要な病因因子であることは、一般的なコンセンサスです。Th1細胞はインターフェロンγ(IFN-γ)を分泌し、Th17細胞はインターロイキン(IL)-17やその他の炎症因子を分泌し、ミクログリア細胞や星状細胞などの他の免疫細胞を活性化する可能性があります。これらの細胞は、IL-18、IL-12、IL-23、IL-1βなどの炎症性サイトカイン7を産生し、Th1/Th17細胞の免疫応答をさらに誘導し、進行性の脱髄と軸索損傷を引き起こす可能性があります。活性化期の観点からは、CD4 T細胞は、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞8を含む、異なる細胞サブセットおよび分化状態に発達する所定の運命を持っている。最初のCD4 T細胞は増殖し、異なる環境で異なる機能を持つさまざまなエフェクターサブセットに分化する9。ほとんどのエフェクター細胞は短命であり、少数のT細胞がメモリーT細胞に成長し、同じ抗原に再遭遇したときに迅速なエフェクター機能を示し、宿主に非常に強力で長期的な保護を提供する10,11。

現在の研究では、CD4 T細胞がEAEの発症に重要な役割を果たしていることが示唆されていますが、活性化段階と免疫効果機能に基づいて分類されたさまざまなCD4 T細胞サブセットがEAEの開始と再発にどのように寄与しているかはまだ不明です。本研究では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55ペプチドを免疫することにより、C57BL6/JマウスにEAEモデルを確立し、CD4 T細胞の活性化期と免疫機能に着目して、EAEの開始と再発を調査しました。

プロトコル

本研究では、6週齢から8週齢の雌C57BL/6Jマウス計18匹を対照群(n = 6)とEAE群(n = 12)に無作為に分けました。マウスは寧夏回族自治区医科大学の実験動物センターから購入しました。マウスは、温度と湿度が制御された部屋に収容され、12時間の明暗サイクルがあり、新鮮な水と食物に自由にアクセスできました。倫理承認は、研究開始前に寧夏回族自治区医科大学の実験動物倫理委員会から取得されました。

1. C57BL/6マウスにおける再発寛解型EAEの開発

  1. 試薬の溶解
    1. 5.4 mg MOG35-55(材料表)を1.8 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に溶解します。12.6 mgの結核菌H37RA(材料表)を秤量し、1.8 mLの完全フロイントアジュバント(CFA)溶液(材料表)に加えます。360μLの百日咳毒素(PTX; 資料表)ピペットを使用して7.2mLのPBSに(Table of Materials)。.
  2. MOG35-55およびCFAのエマルジョンの調製
    1. ステップ1.1で調製した2つの5mLシリンジを使用してMOG35-55溶液とCFA溶液をピペットし、ティーバルブで接続します。乳白色の油中水型エマルジョンが得られるまで、氷上で1時間連続的に混合します。
      注:エマルジョンは、水に落とした後、水面に分散することなく水面に浮いているときに正常に調製されます。
  3. マウス麻酔
    1. 麻酔器の蒸発器の前端にある充填シールキャップを緩めます。中央のシールネジに沿って20mLのイソフルランをゆっくりと注ぎ、充填シールキャップをロックします。ティーバルブスイッチを切り替えて、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔誘導ボックスと通信されるようにします(材料の表)。
    2. エアポンプ電源を接続し、エアポンプスイッチをオンにし、酸素流量計の前端にある空気源バルブを回転させて調整し、出力ガス流量が400mL / minになるようにします。蒸発器を開き、誘導濃度を3%に調整し、麻酔薬が誘導ボックスを満たすのを待ちます。
    3. 約1分後、マウスを誘導ボックスに入れ、誘導ボックスを閉じて、マウスが深い眠り、筋肉の弛緩、安定した呼吸に入るのを待ちます。その後、マウスを麻酔の理想的な状態として決定することができました(材料の表)。
      注意: ティーバルブスイッチを切り替えて、マウスが完全に麻酔されるまで、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔マスクと通信されるようにします。
  4. マウスの免疫
    1. ステップ1.2で調製したエマルジョン200μLを、マウスの背中の4つの部位、EAEグループマウスの腋窩と鼠径部12 の脊椎の両側に針を刺した1mLシリンジを使用して皮下注射します。各部位に50μLのエマルジョンを使用してください(材料表)。
  5. PTXインジェクション
    1. 尾を引っ掛けてマウスをケージから取り出し、ケージワイヤーの上に置きます。マウスの尻尾を4本目と5本目の指で持ち、そっと引き上げることで、体と手足が前に進む傾向を保ちます。マウスの頭をつかみ、中指と薬指を使用してマウスの背中の皮膚を捕らえます。
    2. ステップ1.4の免疫後0時間および48時間後に、針付き1mLシリンジを使用して、中腹部ラインの両側に沿って0.5cmの位置に腹腔内PTX200μLを注入します。
      注:MOG35-55の免疫後48時間でPTXを注入する前に、ステップ1.3で説明した手順を使用してマウスに麻酔をかける必要があります。マウスは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで世話をする必要があります。
    3. 対照群のマウスについては、同じ方法を使用して生理食塩水で治療し、臨床スコアを毎日評価します。
      注:マウスは、次のスケール13に従ってEAEの徴候について評価されました:0 =病気の症状なし、1 =尾の完全な麻痺、2 =部分的な後肢麻痺/脱力感、3 =完全な後肢麻痺、4 =前肢と後肢の麻痺、および5 =瀕死の状態。

2. 組織学的染色解析

  1. ブレインコレクション
    1. ステップ1.3に従ってマウスを麻酔します。子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、胸を開いて心臓を完全に露出させます。耳介を切って、左心室に針付きの20mL注射器を使用して、予冷した生理食塩水でゆっくりと灌流します。
    2. 4%パラホルムアルデヒドで尾先が上を向いて体が硬くなり、肝臓が丈夫になるまでゆっくりと灌流します。頭を斬首し、頭蓋骨を切り、ピンセットを使用して脳を採取し、4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間固定します(資料表)。
  2. パラフィン切片の調製
    1. 勾配脱水:ステップ2.1から脳組織を70%エタノールに1時間、80%エタノールに1時間、95%エタノールに1時間、無水エタノールに1時間連続して浸漬し、新鮮な無水エタノールと交換し、1時間浸漬を続けます(材料の表)。
    2. 透明性:ステップ2.2.1の脳組織をキシレンに30分間浸漬し、新鮮なキシレンと交換し、組織が透明になるまで浸漬を続けます(材料の表)。
    3. 埋め込み:ステップ2.2.2の脳組織をパラフィンに1時間埋め込み、新鮮なパラフィンと交換し、1時間埋め込み続け、離型後に6μmスライスに切断し、スライドをお湯に入れ、37°Cで乾燥させ、室温で保存します(材料表)。
    4. 脱ロウ:ステップ2.2.3の脳組織をキシレンに20分間浸漬し、新鮮なキシレンと交換し、20分間浸漬を続け、無水エタノールに5分間入れ、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、75%エタノールを5分間浸し、水道水ですすいでください(材料の表)。
    5. ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色:ステップ2.2.4の組織をヘマトキシリン溶液で3〜5分間染色し、水道水ですすいでください。組織をヘマトキシリン分化溶液で短時間処理し、水道水で十分にすすいでください。ヘマトキシリンスコットタップブルーイング溶液で組織を処理し、水道水ですすいでください。85%エタノールに5分間、95%エタノールに5分間浸漬し、ステップをエオシン色素で5分間染色します(材料表)。
    6. 脱水:ステップ2.2.5から組織を無水エタノールに連続して5分間浸漬し、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続けます、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、キシレンを5分間浸し、新鮮なキシレンと交換し、5分間浸漬し、中性ガムで密封します(材料の表)。
    7. 顕微鏡を用いて脳組織を観察し、画像取得・解析を行います(資料表)。

3. LFB染色分析

  1. ミエリン鞘コレクション:マウスの背骨を頭端から2セグメント上方へ、尾端から2セグメント下方まで切断し、脊髄を尾端まで吹き飛ばし、脊髄を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間固定します。
    注:ミエリン鞘はステップ2.1で同じマウスから採取され、心臓灌流のステップは2.1と同じです。
  2. パラフィン切片の脱パラフィンと再水和:ステップ3.1のスライドをキシレンに連続して20分間入れ、新鮮なキシレンと交換し、20分間浸漬を続け、無水エタノールを5分間、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、75%アルコールを5分間浸し、水道水で洗浄します。
  3. 速乾性青色染色:ルキゾール速乾性青色染色溶液Aを60°Cのオーブンに入れ、30分間予熱します。ステップ3.2のスライドを溶液Aに入れ、スライスが乾燥しないようにプラスチックメンブレンで1時間覆った後、スライドを取り出して水道水ですばやく洗います。
  4. 背景の分化:ステップ3.3のスライドをルキソール速粘液Bに2秒間(染料が熱い間)、直接ルキソール速粘青色染色液Cに浸して分化し、ミエリン鞘が青くなり、背景がほぼ無色になるまで水で洗浄します。
  5. エオシン対比染色:ステップ3.4のスライドを65°Cのオーブンに入れて乾燥させます。完了したら、オーブンから取り出して冷まします。スライドを95%エタノールとエオシンの対比染色に1分間入れます。
  6. 脱水とシーリング:ステップ3.5のスライドを無水エタノール5分に連続して入れ、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続け、再び新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続け、キシレン5分、新鮮なキシレンと交換し、5分間浸漬します。サンプルを洗浄して乾燥させ、中性ガムで密封します。
  7. 顕微鏡検査:正立型光学顕微鏡(Table of Materials)を使用して画像を収集し、分析します。

4. フローサイトメトリー解析

  1. マウスの腹腔を開きます。ピンセットを使用して脾臓を抽出し、はさみを使用して氷の上でPBSで1.5〜2.5cmの小片にミンチします。2.5 mLシリンジピストンを使用して、2%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI-1640 10 mLで脾臓を粉砕し、70 μmのセルストレーナーに押し込んでシングルセル懸濁液を得ます(材料表)。
    注:脾臓は、ステップ2.1で同じマウスから採取しました。
  2. ステップ4.1で得られた懸濁液を15 mLチューブに移し、5 mLの赤血球溶解バッファーを氷上で10分間溶解します。2% FBSを含むRPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、2% FBSを含むRPMI-1640で細胞を再懸濁します。
  3. 自動セルカウンター(Table of Materials)で細胞をカウントし、濃度を1 x 106 細胞/mLに調整します。
  4. 100 μL の細胞懸濁液を 1.5 mL チューブにピペットで移し、1 μL の抗マウス CD16/32 抗体14 (0.5 mg/mL) と 30 分間インキュベートして、非特異的染色をブロックします。RPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。2% FBSを含むRPMI-1640の100 μLに細胞を再懸濁します。
  5. Teff細胞15 のCD45(Alexa Fluor 700)、CD3(FITC)、CD4(APC)、およびCD69(BV674)に特異的な抗体で30分間、各抗体につき2 μLで染色します。Tem細胞16 のCD45(Alexa Fluor 700)、CD3(FITC)、CD4(APC)、CD44(BV421)、およびCD62L(PE)に特異的な抗体で30分間、各抗体につき2 μLで染色します。RPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄して細胞を350 μLのPBSに再懸濁します。フローサイトメーターと関連ソフトウェア(Table of Materials)を使用して細胞比率を解析します。

5. サイトメトリービーズアレイによるサイトカインの解析

  1. サイトメトリービーズアレイ(Table of Materials)を使用して、マウスの脳におけるIL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘍壊死因子(TNF)-αおよびIFN-γを測定するために、以下に説明する方法。
  2. ステップ2.1で説明したようにマウスの脳を採取します。
  3. 総タンパク質の抽出:50 mgの脳組織(対照群の3つの脳、ピーク段階のEAE群、およびRR段階)を切断して重量を量ります。1.5 mLチューブに脳を入れ、PMSF、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む500 μLの溶解バッファーを加えます。
  4. 脳を約1mm3の小片に切り、超音波ホモジナイザーで400W、5秒オン、5秒オフで抽出します。5回繰り返します。チューブを氷上に10分間置き、12000 x g で5分間遠心分離し、上清を回収します(材料表)。
  5. マウスTh1/Th2/Th17サイトカインスタンダードを下記のように調製します。
    1. 凍結乾燥マウスTh1/Th2/Th17スタンダードのバイアルを開きます。標準試料を15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。チューブトップに標準としてラベルを付けます。
    2. 標準試料を 2.0 mL のアッセイ希釈液で再構成します。再構成した標準試料を室温で15分間平衡化します。再構成したタンパク質をピペッティングで穏やかに混合します。
    3. 12 mm x 75 mmチューブにラベルを貼り、希釈の順番に並べます:1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。各標識チューブにアッセイ希釈液300μLをピペットで入れます。
    4. 段階希釈を行う:トップスタンダードの300μLを1:2希釈チューブに移し、ピペッティングで完全に混合します。1:2チューブから1:4チューブに300μLを移し、1:256チューブまで移して段階希釈を続けます。0 pg/mLネガティブコントロールとして機能するアッセイ希釈液のみを含む12 mm x 75 mmチューブを準備します。
      注:ピペッティングで十分に混合します。マイクロビーズ上の抗体結合が脱落するのを防ぐためにボルテックスしないでください。
    5. マウスTh1/Th2/Th17サイトカインキャプチャービーズを混合するには、各グループ(コントロールグループ、ピークステージのEAEグループ、RRステージ)に3つのサンプルを含む標準を含む19本のチューブを実験用に調製します。捕獲ビーズ懸濁液を5秒間激しくボルテックスしてから混合します。各キャプチャービーズ190 μLを1つのチューブに添加し、混合キャプチャービーズとして標識します。ビーズ混合物を徹底的にボルテックスします。
      注:抗体標識ビーズは、時間の経過とともに懸濁液から沈降します。ビーズ懸濁液を採取する前に、バイアルをボルテックスする必要があります。
    6. アッセイを行うには、ミックスキャプチャビーズをボルテックスします。50 μLのビーズをすべてのアッセイチューブに加えます。 表1に示すように、50 μLのマウスTh1/Th2/Th17サイトカイン標準希釈液をコントロールチューブに加えます。
    7. マウスTh1/Th2/Th17 PE検出試薬50 μLをすべてのアッセイチューブに加えます。アッセイチューブを室温で2時間インキュベートし、光から保護します。各アッセイチューブに1 mLの洗浄バッファーを加え、200 x g で5分間遠心分離します。各アッセイチューブから上清を吸引し、慎重に廃棄します。
    8. 各アッセイチューブに300 μLの洗浄バッファーを加えて、ビーズペレットを再懸濁します。FCAP Arrayソフトウェア(Table of Materials)を用いてマウスTh1/Th2/Th17サイトカインデータを解析します。

  

結果

クリニカルスコア評価
図1に示すように、対照群のマウスは臨床症状を示さなかった。MOG35-55を免疫したEAE群のマウスは、免疫後約12日で尾部麻痺を示しました。16日目までに、症状は完全な後肢麻痺(ピークステージ、ピークとして定義)に達しました。その後、徐々に症状が治まっていきました。マウスの臨床症状は25日目頃に悪?...

ディスカッション

MSは、CNSの中で最も蔓延している自己免疫性脱髄疾患であり、世界中で何百万人もの人々が罹患しています17。EAEは、MS18の臨床病理学的特徴をシミュレートするための典型的な動物モデルです。研究によると、MSの個人は、CNSの軸索とニューロンの変性により、認知障害やその他の障害を経験することが示されています19,20,21。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、寧夏回族自治区自然科学財団(2022AAC03601および2023AAC02087)および寧夏医科大学研究財団(XM2019052)の支援を受けました。寧夏医科大学の医学科学技術研究センターの支援に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machine evaporatorNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.792632
70 μm cell strainerXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103128
APC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100616
Automatic cell counterJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 AntibodyBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction KitShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. SLCH4887
DehydratorDIAPATHDonatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)Yikang Group210820
Dyeing machineDIAPATHGiotto
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EthanolSCRC100092683
Fetal Bovine SerumProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Glass slideServicebioG6004
HE dye solution setServicebioG1003
Hematoxylin-Eosin solutionServicebioG1002
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Imaging systemNikonNIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kitServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Neutral gumSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Pathology slicerLeicaRM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Pipette 0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
Pipette 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
Pipette 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.PM150110
Tee valveGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Tissue spreaderZhejiang Kehua Instrument Co.,LtdKD-P
Upright optical microscopeNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418

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