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Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを使用して、活性化段階と免疫効果機能の観点から、EAEの初期および再発におけるCD4T細胞の役割を調査しました。
多発性硬化症(MS)は、免疫細胞の浸潤と中枢神経系(CNS)での脱髄を特徴とする自己免疫疾患です。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、多発性硬化症を研究するためのプロトタイプ動物モデルとして機能します。本研究では、CD4 T細胞がEAEの開始と再発に関与する役割について、活性化期と免疫応答に着目して検討することを目指しました。EAEマウスモデルを作成するために、雌マウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化して免疫しました。臨床スコアは毎日評価され、その結果、EAEグループのマウスは古典的な再発寛解パターンを示したことが示されました。ヘマトキシリン-エオシン(H&E)およびルキソールファストブルー(LFB)染色分析により、中枢神経系の炎症細胞の有意な浸潤とEAEマウスの脱髄が明らかになりました。活性化期については、CD4+CD69+エフェクターT(Teff)細胞とCD4+CD44+CD62L-エフェクターメモリーT(Tem)細胞の両方がEAEの開始に寄与している可能性があるが、再発期はCD4+CD44+CD62L-Tem細胞が優勢であった可能性が高い。さらに、免疫機能に関しては、ヘルパーT(Th)1細胞が主にEAEの開始に関与しています。しかし、Th1細胞とTh17細胞の両方が再発期に寄与し、EAEの病理学的過程では制御性T(Treg)細胞の免疫抑制機能が阻害されました。
多発性硬化症(MS)は、免疫細胞による中枢神経系(CNS)の浸潤と脱髄を特徴とする自己免疫疾患です1,2。最近の研究では、若者が罹患する最も一般的な障害疾患であり、その発生率は世界中で継続的に増加していることが示されています3。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、ヒト MS4 の炎症期の多くの側面をシミュレートする MS のプロトタイプ動物モデルです。免疫機能の観点から、まだ抗原に遭遇していない最初のCD4 T細胞はヘルパーT(Th)0細胞と呼ばれます。これらの細胞は、成熟と活性化の過程を経て、さまざまな機能を発揮します。CD4 T細胞は、その特定の機能に応じて、Th1、Th2、制御性T(Treg)、濾胞ヘルパーT(Tfh)、Th17、Th9、およびTh22細胞5を含む、いくつかのサブセットに分類することができる。Th1およびTh17細胞サブタイプがEAE6の重要な病因因子であることは、一般的なコンセンサスです。Th1細胞はインターフェロンγ(IFN-γ)を分泌し、Th17細胞はインターロイキン(IL)-17やその他の炎症因子を分泌し、ミクログリア細胞や星状細胞などの他の免疫細胞を活性化する可能性があります。これらの細胞は、IL-18、IL-12、IL-23、IL-1βなどの炎症性サイトカイン7を産生し、Th1/Th17細胞の免疫応答をさらに誘導し、進行性の脱髄と軸索損傷を引き起こす可能性があります。活性化期の観点からは、CD4 T細胞は、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞8を含む、異なる細胞サブセットおよび分化状態に発達する所定の運命を持っている。最初のCD4 T細胞は増殖し、異なる環境で異なる機能を持つさまざまなエフェクターサブセットに分化する9。ほとんどのエフェクター細胞は短命であり、少数のT細胞がメモリーT細胞に成長し、同じ抗原に再遭遇したときに迅速なエフェクター機能を示し、宿主に非常に強力で長期的な保護を提供する10,11。
現在の研究では、CD4 T細胞がEAEの発症に重要な役割を果たしていることが示唆されていますが、活性化段階と免疫効果機能に基づいて分類されたさまざまなCD4 T細胞サブセットがEAEの開始と再発にどのように寄与しているかはまだ不明です。本研究では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55ペプチドを免疫することにより、C57BL6/JマウスにEAEモデルを確立し、CD4 T細胞の活性化期と免疫機能に着目して、EAEの開始と再発を調査しました。
本研究では、6週齢から8週齢の雌C57BL/6Jマウス計18匹を対照群(n = 6)とEAE群(n = 12)に無作為に分けました。マウスは寧夏回族自治区医科大学の実験動物センターから購入しました。マウスは、温度と湿度が制御された部屋に収容され、12時間の明暗サイクルがあり、新鮮な水と食物に自由にアクセスできました。倫理承認は、研究開始前に寧夏回族自治区医科大学の実験動物倫理委員会から取得されました。
1. C57BL/6マウスにおける再発寛解型EAEの開発
2. 組織学的染色解析
3. LFB染色分析
4. フローサイトメトリー解析
5. サイトメトリービーズアレイによるサイトカインの解析
クリニカルスコア評価
図1に示すように、対照群のマウスは臨床症状を示さなかった。MOG35-55を免疫したEAE群のマウスは、免疫後約12日で尾部麻痺を示しました。16日目までに、症状は完全な後肢麻痺(ピークステージ、ピークとして定義)に達しました。その後、徐々に症状が治まっていきました。マウスの臨床症状は25日目頃に悪?...
MSは、CNSの中で最も蔓延している自己免疫性脱髄疾患であり、世界中で何百万人もの人々が罹患しています17。EAEは、MS18の臨床病理学的特徴をシミュレートするための典型的な動物モデルです。研究によると、MSの個人は、CNSの軸索とニューロンの変性により、認知障害やその他の障害を経験することが示されています19,20,21。
著者は何も開示していません。
この研究は、寧夏回族自治区自然科学財団(2022AAC03601および2023AAC02087)および寧夏医科大学研究財団(XM2019052)の支援を受けました。寧夏医科大学の医学科学技術研究センターの支援に感謝します。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia machine evaporator | Norvap | 20-17368 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 792632 | |
70 μm cell strainer | XIYAN Co.,Ltd. | 15-1070 | |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103128 | |
APC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100616 | |
Automatic cell counter | Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD | JIMBIO iCyta S2 | |
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit | BD Biosciences | 560485 | |
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101303 | |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody | Biolegend | 104532 | |
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14) | BD Pharmingen | 563109 | |
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd | PC201Plus | |
Complete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLCH4887 | |
Dehydrator | DIAPATH | Donatello | |
Disposable sterilized syringe (1 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (2.5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Dyeing machine | DIAPATH | Giotto | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Ethanol | SCRC | 100092683 | |
Fetal Bovine Serum | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | FSP500 | |
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11) | BD Pharmingen | 553062 | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCelesta | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | Accuri C6 | |
Flow Jo software | BD Biosciences | 10.8.1 | |
Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Glass slide | Servicebio | G6004 | |
HE dye solution set | Servicebio | G1003 | |
Hematoxylin-Eosin solution | Servicebio | G1002 | |
High speed refrigerated centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Mogafugo8R | |
Imaging system | Nikon | NIKON DS-U3 | |
Luxol fast blue staining kit | Servicebio | G1030 | |
Ms CD44 BV421 IM7 | BD Pharmingen | 564970 | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | BD Pharmingen | 231141 | |
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) | AnaSpec | AS-60130-1 | |
Neutral gum | SCRC | 10004160 | |
Organizer | KEDEE | KD-P | |
Oven | Labotery | GFL-230 | |
Pathology slicer | Leica | RM2016 | |
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | P7208 | |
Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
Pipette 0.5-10 μL | DLAB Scientific | 7010101004 | |
Pipette 100-1000 μL | DLAB Scientific | 7010101014 | |
Pipette 20-200 μL | DLAB Scientific | 7010101009 | |
RPMI-1640 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | PM150110 | |
Tee valve | Guangdong Kanghua Medical Co., LTD | A06 | |
Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd | KD-P | |
Upright optical microscope | Nikon | NIKON ECLIPSE E100 | |
Xylene | SCRC | 10023418 |
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