Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Farelerde deneysel bir otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli, CD4 T hücrelerinin EAE'nin başlangıç ve nüksetmesindeki rolünü aktivasyon fazı ve immün etki fonksiyonu perspektifinden araştırmak için kullanıldı.
Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin infiltrasyonu ve merkezi sinir sisteminde (MSS) demiyelinizasyon ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), MS'i incelemek için prototipik bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Bu çalışmada, EAE'nin başlaması ve nüksetmesinde CD4 T hücrelerinin rolünü, aktivasyon fazı ve immün yanıta odaklanarak araştırmayı amaçladık. EAE fare modelini oluşturmak için dişi fareler, tam Freund adjuvanı (CFA) ile emülsifiye edilmiş miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG)35-55 ile aşılandı. Klinik skorlar günlük olarak değerlendirildi ve sonuçlar, EAE grubundaki farelerin klasik bir nükseden-düzelme paterni sergilediğini gösterdi. Hematoksilen-eozin (H&E) ve luxol hızlı mavi (LFB) boyama analizi, EAE farelerinde CNS'de inflamatuar hücrelerin önemli ölçüde infiltrasyonunu ve demiyelinizasyonu ortaya çıkardı. Aktivasyon fazı ile ilgili olarak, hem CD4 + CD69 + efektör T (Teff) hücreleri hem de CD4 + CD44 + CD62L- efektör bellek T (Tem) hücreleri EAE'nin başlamasına katkıda bulunabilir, ancak nüks aşamasına muhtemelen CD4 + CD44 + CD62L-Tem hücreleri hakimdir. Ek olarak, bağışıklık fonksiyonu açısından, yardımcı T (Th)1 hücreleri öncelikle EAE'nin başlatılmasında rol oynar. Bununla birlikte, hem Th1 hem de Th17 hücreleri nüks aşamasına katkıda bulunur ve düzenleyici T (Treg) hücrelerinin immünosüpresif fonksiyonu EAE patolojik süreci sırasında inhibe edilmiştir.
Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminin (MSS) immün hücrelerle infiltrasyonu ve demiyelinizasyon ile karakterize otoimmün bir hastalıktır 1,2. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, gençleri etkileyen en yaygın sakatlayıcı hastalık olduğunu ve insidansının dünya çapında sürekli arttığını göstermiştir3. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan MS4'ün enflamatuar fazının birçok yönünü simüle eden MS için prototipik bir hayvan modelidir. İmmün fonksiyonlar açısından bakıldığında, henüz antijenlerle karşılaşmamış olan başlangıç CD4 T hücreleri, yardımcı T(Th) 0 hücreleri olarak adlandırılır. Bu hücreler çeşitli işlevler sergilemek için olgunlaşma ve aktivasyon işlemlerinden geçerler. CD4 T hücreleri, Th1, Th2, düzenleyici T (Treg), foliküler yardımcı T (Tfh), Th17, Th9 ve Th22 hücreleri5 dahil olmak üzere spesifik işlevlerine göre birkaç alt kümeye ayrılabilir. Th1 ve Th17 hücre alt tiplerinin EAE6'nın önemli patogenez faktörleri olduğu yaygın bir kanıdır. Th1 hücreleri interferon γ (IFN-γ) salgılayabilir ve Th17 hücreleri interlökin (IL)-17 ve mikroglial hücreler ve astrositler gibi diğer bağışıklık hücrelerini aktive edebilen diğer inflamatuar faktörleri salgılar. Bu hücreler, IL-18, IL-12, IL-23 ve IL-1β gibi inflamatuar sitokinler7 üretir, bu da Th1 / Th17 hücrelerinin bağışıklık tepkisini daha fazla indükleyerek ilerleyici demiyelinizasyon ve aksonal hasara neden olabilir. Aktivasyon fazı perspektifinden bakıldığında, CD4 T hücreleri, naif, efektör ve bellek T hücreleri8 dahil olmak üzere farklı hücre alt kümelerine ve farklılaşmış durumlara dönüşmek için önceden belirlenmiş bir kadere sahiptir. İlk CD4 T hücreleri çoğalır ve farklı ortamlarda farklı işlevlere sahip çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşır9. Efektör hücrelerin çoğu kısa ömürlüdür ve küçük bir T hücresi popülasyonu, aynı antijenlerle tekrar karşılaştığında hızlı efektör işlevler sergileyen ve konakçıya oldukça güçlü ve uzun süreli koruma sağlayan bellek T hücrelerine dönüşür10,11.
Mevcut araştırmalar, CD4 T hücrelerinin EAE'nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını öne sürse de, aktivasyon fazlarına ve immün etki fonksiyonlarına göre sınıflandırılan farklı CD4 T hücresi alt kümelerinin EAE'nin başlamasına ve nüksetmesine nasıl katkıda bulunduğu hala belirsizdir. Bu çalışmada, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55 peptidini immünize ederek C57BL6/J farelerde EAE modeli oluşturuldu ve CD4 T hücrelerinin aktivasyon fazı ve immün fonksiyonuna odaklanarak EAE'nin başlaması ve nüksetmesi araştırıldı.
Bu çalışma için altı ila sekiz haftalık toplam 18 dişi C57BL / 6J faresi rastgele bir kontrol grubuna (n = 6) ve bir EAE grubuna (n = 12) ayrıldı. Fareler, Ningxia Tıp Üniversitesi'nin deney hayvanı merkezinden satın alındı. Fareler, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsüne ve tatlı su ve yiyeceğe ücretsiz erişime sahip, sıcaklık ve nem kontrollü bir odaya yerleştirildi. Çalışma başlamadan önce Ningxia Tıp Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu'ndan etik onay alındı.
1. C57BL / 6 farelerde tekrarlayan remitting EAE'nin geliştirilmesi
2. Histolojik boyama analizi
3. LFB boyama analizi
4. Akış sitometrisi analizi
5. Sitometrik boncuk dizisi ile sitokinlerin analizi
Klinik puanların değerlendirilmesi
Şekil 1'de gösterildiği gibi, kontrol grubundaki fareler herhangi bir klinik semptom göstermedi. MOG35-55 ile aşılanan EAE grubundaki fareler, aşılamadan yaklaşık 12 gün sonra kuyruk felci gösterdi. 16. günde, semptomlar tam arka bacak felcine ulaştı (tepe evresi, Tepe olarak tanımlanır). Bundan sonra, semptomlar yavaş yavaş havale edildi. Farelerin klinik semptomları yaklaşık 25....
MS, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen CNS'nin en yaygın otoimmün demiyelinizan hastalığıdır17. EAE, MS18'in klinik patolojik özelliklerini simüle etmek için tipik bir hayvan modelidir. Çalışmalar, MS'li bireylerin CNS'deki akson ve nöronların dejenerasyonu nedeniyle bilişsel bozukluk ve diğer sakatlıklar yaşadığını göstermiştir 19,20,21.
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Bu çalışma, Ningxia Doğa Bilimleri Vakfı (2022AAC03601 ve 2023AAC02087) ve Ningxia Tıp Üniversitesi Araştırma Vakfı (XM2019052) tarafından desteklenmiştir. Ningxia Tıp Üniversitesi Tıp Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Merkezi'nin desteği için teşekkür ederiz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia machine evaporator | Norvap | 20-17368 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 792632 | |
70 μm cell strainer | XIYAN Co.,Ltd. | 15-1070 | |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103128 | |
APC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100616 | |
Automatic cell counter | Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD | JIMBIO iCyta S2 | |
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit | BD Biosciences | 560485 | |
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101303 | |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 Antibody | Biolegend | 104532 | |
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14) | BD Pharmingen | 563109 | |
Column Tissue&Cell Protein Extraction Kit | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd | PC201Plus | |
Complete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLCH4887 | |
Dehydrator | DIAPATH | Donatello | |
Disposable sterilized syringe (1 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (2.5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Disposable sterilized syringe (5 mL) | Yikang Group | 210820 | |
Dyeing machine | DIAPATH | Giotto | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Ethanol | SCRC | 100092683 | |
Fetal Bovine Serum | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | FSP500 | |
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11) | BD Pharmingen | 553062 | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCelesta | |
Flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | Accuri C6 | |
Flow Jo software | BD Biosciences | 10.8.1 | |
Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Glass slide | Servicebio | G6004 | |
HE dye solution set | Servicebio | G1003 | |
Hematoxylin-Eosin solution | Servicebio | G1002 | |
High speed refrigerated centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Mogafugo8R | |
Imaging system | Nikon | NIKON DS-U3 | |
Luxol fast blue staining kit | Servicebio | G1030 | |
Ms CD44 BV421 IM7 | BD Pharmingen | 564970 | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | BD Pharmingen | 231141 | |
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) | AnaSpec | AS-60130-1 | |
Neutral gum | SCRC | 10004160 | |
Organizer | KEDEE | KD-P | |
Oven | Labotery | GFL-230 | |
Pathology slicer | Leica | RM2016 | |
Pertussis Toxin from Bordetella pertussis | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | P7208 | |
Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
Pipette 0.5-10 μL | DLAB Scientific | 7010101004 | |
Pipette 100-1000 μL | DLAB Scientific | 7010101014 | |
Pipette 20-200 μL | DLAB Scientific | 7010101009 | |
RPMI-1640 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | PM150110 | |
Tee valve | Guangdong Kanghua Medical Co., LTD | A06 | |
Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd | KD-P | |
Upright optical microscope | Nikon | NIKON ECLIPSE E100 | |
Xylene | SCRC | 10023418 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır