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Resumo

Um modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) em camundongos foi empregado para investigar o papel das células T CD4 na fase inicial e na recidiva da EAE sob a perspectiva da fase de ativação e função do efeito imunológico.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune caracterizada pela infiltração de células imunes e desmielinização no sistema nervoso central (SNC). A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como um modelo animal prototípico para o estudo da EM. Neste estudo, objetivamos investigar o papel das células T CD4 na iniciação e recidiva da EAE, com foco na fase de ativação e resposta imune. Para criar o modelo de camundongos EAE, camundongos fêmeas foram imunizados com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG)35-55 emulsionada com adjuvante de Freund completo (CFA). Os escores clínicos foram avaliados diariamente e os resultados demonstraram que os camundongos do grupo EAE exibiram um padrão clássico de remitência-recorrente. A análise da coloração de hematoxilina-eosina (H&E) e luxol fast blue (LFB) revelou infiltração significativa de células inflamatórias no SNC e desmielinização em camundongos EAE. Em relação à fase de ativação, tanto as células T efetoras CD4+CD69+ (Teff) quanto as células T de memória efetora CD4+CD44+CD62L- (Tem) podem contribuir para o início da EAE, no entanto, o estágio de recidiva provavelmente foi dominado pelas células Tem CD4+CD44+CD62L-. Além disso, em termos de função imunológica, as células T (Th)1 auxiliares estão envolvidas principalmente no início do EAE. No entanto, as células Th1 e Th17 contribuem para o estágio de recidiva, e a função imunossupressora das células T reguladoras (Treg) foi inibida durante o processo patológico da EAE.

Introdução

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune que se caracteriza pela infiltração do sistema nervoso central (SNC) com células imunes e desmielinização 1,2. Um estudo recente mostrou que é a doença incapacitante mais comum que afeta os jovens, com sua incidência aumentando continuamente em todo o mundo3. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal prototípico para EM que simula muitos aspectos da fase inflamatória da EM humana4. Do ponto de vista das funções imunológicas, as células T CD4 iniciais que ainda não encontraram antígenos são chamadas de células T (Th) 0 auxiliares. Essas células passam por processos de maturação e ativação para exibir várias funções. As células T CD4 podem ser categorizadas em vários subconjuntos de acordo com suas funções específicas, que incluem células Th1, Th2, T reguladora (Treg), T folicular auxiliar (Tfh), Th17, Th9 e Th225. É um consenso comum que os subtipos de células Th1 e Th17 são fatores cruciais de patogênese da EAE6. As células Th1 podem secretar interferon γ (IFN-γ) e as células Th17 secretam interleucina (IL)-17 e outros fatores inflamatórios, que podem ativar outras células imunes, como células microgliais e astrócitos. Essas células produzem citocinas inflamatórias7, como IL-18, IL-12, IL-23 e IL-1β, que podem induzir ainda mais a resposta imune das células Th1/Th17, resultando em desmielinização progressiva e dano axonal. Do ponto de vista da fase de ativação, as células T CD4 possuem um destino predeterminado para se desenvolver em subconjuntos celulares distintos e estados diferenciados, incluindo células T ingênuas, efetoras e de memória8. As células T CD4 iniciais proliferam e se diferenciam em uma variedade de subconjuntos efetores com diferentes funções em diferentes ambientes9. A maioria das células efetoras tem vida curta, com uma pequena população de células T se desenvolvendo em células T de memória que exibem funções efetoras rápidas ao reencontrar os mesmos antígenos e fornecem ao hospedeiro proteção altamente potente e de longo prazo10,11.

Embora a pesquisa atual sugira que as células T CD4 desempenham um papel significativo no desenvolvimento da EAE, ainda não está claro como diferentes subconjuntos de células T CD4, classificados com base em sua fase de ativação e função de efeito imunológico, contribuem para o início e a recidiva da EAE. No presente estudo, estabelecemos o modelo EAE em camundongos C57BL6/J imunizando o peptídeo glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG)35-55 e investigamos a iniciação e recidiva de EAE, com foco na fase de ativação e função imune de células T CD4.

Protocolo

Um total de 18 camundongos C57BL/6J fêmeas com idades entre seis e oito semanas foram divididos aleatoriamente em um grupo controle (n = 6) e um grupo EAE (n = 12) para este estudo. Os ratos foram comprados no centro de experimentos com animais da Universidade Médica de Ningxia. Os ratos foram alojados em uma sala com temperatura e umidade controladas com um ciclo claro/escuro de 12 horas e livre acesso a água doce e alimentos. A aprovação ética foi obtida do Comitê de Ética em Animais Experimentais da Universidade Médica de Ningxia antes do início do estudo.

1. Desenvolvimento de EAE remitente recorrente em camundongos C57BL/6

  1. Dissolução de reagentes
    1. Dissolva 5,4 mg de MOG35-55 (Tabela de Materiais) em 1,8 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Pese 12,6 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Tabela de Materiais) e adicione-o a 1,8 mL de solução completa de adjuvante de Freund (CFA) (Tabela de Materiais). Dissolva 360 μL de toxina pertussis (PTX; Tabela de Materiais) em 7,2 mL de PBS usando uma pipeta (Tabela de Materiais).
  2. Preparação da emulsão de MOG35-55 e CFA
    1. Pipete a solução MOG35-55 e a solução CFA usando duas seringas de 5 mL preparadas na etapa 1.1 e conecte-as com uma válvula em T. Misture continuamente no gelo por 1 h até obter uma emulsão leitosa de água em óleo.
      NOTA: A emulsão é preparada com sucesso quando está flutuando na superfície da água sem se dispersar após deixá-la cair na água.
  3. Anestesia em camundongos
    1. Desaparafuse a tampa de vedação de enchimento na extremidade frontal do evaporador da máquina de anestesia. Despeje lentamente 20 mL de isoflurano ao longo do parafuso de vedação no centro e trave a tampa de vedação de enchimento. Troque o interruptor da válvula em T para garantir que o fluxo de ar do evaporador da máquina de anestesia seja comunicado com a caixa de indução de anestesia (Tabela de Materiais).
    2. Conecte a fonte de alimentação da bomba de ar, ligue o interruptor da bomba de ar e gire e ajuste a válvula da fonte de ar na extremidade frontal do medidor de fluxo de oxigênio para que o fluxo de gás de saída seja de 400 mL/min. Abra o evaporador, ajuste a concentração de indução para 3% e espere que o anestésico encha a caixa de indução.
    3. Cerca de 1 minuto depois, coloque os ratos na caixa de indução, feche a caixa de indução e espere que os ratos estejam em sono profundo, relaxamento muscular e respiração constante; então, os camundongos poderiam ser determinados como o estado ideal de anestesia (Tabela de Materiais).
      NOTA: Troque o interruptor da válvula em T para garantir que o fluxo de ar do evaporador da máquina de anestesia seja comunicado com a máscara de anestesia até que os camundongos estejam totalmente anestesiados.
  4. Imunização de camundongos
    1. Injete subcutaneamente 200 μL de emulsão preparada na etapa 1.2 usando uma seringa de 1 mL com a agulha em quatro locais nas costas do camundongo, cerca de 0,5 cm em ambos os lados da coluna na axila e no plano da virilha12 nos camundongos do grupo EAE. Use 50 μL de emulsão em cada local (Tabela de Materiais).
  5. Injeção de PTX
    1. Retire os ratos da gaiola pegando a cauda e coloque-a no arame da gaiola. Segure a cauda dos ratos com o 4º e o 5º dedos e puxe-a suavemente para cima para manter a tendência do corpo e dos membros para a frente. Segure a cabeça dos ratos e capture a pele nas costas dos ratos usando os dedos médio e anelar.
    2. Às 0 h e 48 h após a imunização na etapa 1.4, injete 200 μL de PTX por via intraperitoneal na posição de 0,5 cm ao longo de cada lado da linha abdominal média com a profundidade de penetração de 1-2 cm usando uma seringa de 1 mL com agulha (Tabela de Materiais).
      NOTA: Antes de injetar PTX 48 h após a imunização de MOG35-55, é necessário anestesiar camundongos usando os procedimentos descritos na etapa 1.3. Os camundongos devem ser atendidos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
    3. Para os camundongos do grupo controle, trate com solução salina usando o mesmo método e avalie o escore clínico diariamente.
      NOTA: Os camundongos foram avaliados quanto a sinais de EAE de acordo com a seguinte escala13: 0 = sem sintomas da doença, 1 = paralisia completa da cauda, 2 = paralisia / fraqueza parcial da parte posterior, 3 = paralisia completa dos membros posteriores, 4 = paralisia dos membros anteriores e posteriores e 5 = estado moribundo.

2. Análise histológica de coloração

  1. Coleção de cérebros
    1. Anestesie os ratos seguindo o passo 1.3. Eutanasiar os camundongos por luxação cervical e abrir o tórax para expor totalmente o coração. Corte a aurícula extra e perfunda lentamente com uma solução salina pré-resfriada usando uma seringa de 20 mL com agulha no ventrículo esquerdo até que o fígado fique cinza e branco.
    2. Perfunda lentamente com paraformaldeído a 4% até que a ponta da cauda apareça, o corpo fique rígido e o fígado fique duro. Decapite a cabeça, corte o crânio, colete o cérebro com uma pinça e fixe-o em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h (Tabela de Materiais).
  2. Preparação de seções de parafina
    1. Desidratação gradiente: Mergulhe os tecidos cerebrais da etapa 2.1 sucessivamente em etanol a 70% por 1 h, etanol a 80% por 1 h, etanol a 95% por 1 h, etanol anidro por 1 h, substitua por etanol anidro fresco, continue imergindo por 1 h (Tabela de Materiais).
    2. Transparência: Mergulhe os tecidos cerebrais da etapa 2.2.1 em xileno por 30 min, substitua-os por xileno fresco e continue imergindo até que os tecidos fiquem transparentes (Tabela de Materiais).
    3. Incorporação: Incorpore os tecidos cerebrais da etapa 2.2.2 em parafina por 1 h, substitua por parafina fresca, continue embutindo por 1 h, corte em fatias de 6 μm após a liberação do molde, coloque a lâmina em água quente, seque a 37 ° C, armazene em temperatura ambiente (Tabela de Materiais).
    4. Desparafinação: Mergulhe os tecidos cerebrais da etapa 2.2.3 em xileno por 20 min, substitua por xileno fresco, continue imergindo por 20 min, coloque em etanol anidro por 5 min, substitua por etanol anidro fresco, mergulhe por 5 min, etanol 75% por 5 min, enxágue com água da torneira (Tabela de Materiais).
    5. Coloração de hematoxilina-eosina (H & E): Manchar os tecidos da etapa 2.2.4 com solução de hematoxilina por 3-5 min e depois enxaguar com água da torneira. Trate os tecidos com uma solução de diferenciação de hematoxilina, brevemente e enxágue abundantemente com água da torneira. Trate os tecidos com hematoxilina Scott tap solução azulada e enxágue com água da torneira. Mergulhe em etanol a 85% por 5 min e etanol a 95% por 5 min e pinte as etapas com corante de eosina por 5 min (Tabela de Materiais).
    6. Desidratar: Mergulhe os tecidos da etapa 2.2.5 sucessivamente em etanol anidro por 5 min, substitua por etanol anidro fresco, continue imergindo por 5 min, substitua por etanol anidro fresco, mergulhe por 5 min, xileno por 5 min, substitua por xileno fresco, mergulhe por 5 min, sele com goma neutra (Tabela de Materiais).
    7. Observar ao microscópio os tecidos cerebrais e realizar a aquisição e análise de imagens (Tabela de Materiais).

3. Análise de coloração LFB

  1. Coleta da bainha de mielina: Corte a coluna vertebral do camundongo do terminal da cabeça até 2 segmentos até o terminal da cauda 2 segmentos, sopre a medula espinhal até o terminal da cauda e fixe a medula espinhal em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h.
    NOTA: A bainha de mielina foi colhida dos mesmos camundongos na etapa 2.1, e as etapas para perfusão cardíaca são as mesmas da etapa 2.1.
  2. Desparafinização e reidratação de seções de parafina: Coloque as lâminas da etapa 3.1 sucessivamente em xileno por 20 min, substitua por xileno fresco, continue imergindo por 20 min, etanol anidro por 5 min, substitua por etanol anidro fresco, mergulhe por 5 min, álcool 75% por 5 min, lave com água da torneira.
  3. Coloração azul rápida: Coloque a solução de coloração azul rápida luxol A em um forno a 60 ° C e pré-aqueça por 30 min. Coloque as lâminas da etapa 3.2 na solução A e cubra-as com uma membrana plástica por 1 h para evitar que as fatias sequem, depois retire as lâminas e lave-as rapidamente com água da torneira.
  4. Diferenciação de fundo: Coloque as lâminas da etapa 3.3 na solução de coloração azul rápida luxol B por 2 s (enquanto o corante estiver quente) e mergulhe diretamente na solução de coloração azul rápida luxo C para diferenciação por 15 s, lave com água até que a bainha de mielina fique azul e o fundo seja quase incolor.
  5. Contra-coloração de eosina: Coloque as lâminas da etapa 3.4 no forno a 65 °C para secar. Feito isso, retire-os do forno e deixe esfriar. Coloque as lâminas em etanol a 95% e contracoloração de eosina por 1 min.
  6. Desidratação e vedação: Coloque as lâminas da etapa 3.5 sucessivamente em etanol anidro 5 min, substitua por etanol anidro fresco, continue imergindo por 5 min, substitua por etanol anidro fresco novamente, continue imergindo por 5 min, xileno 5 min, substitua por xileno fresco, mergulhe por 5 min. Lave e seque as amostras e sele-as com goma neutra.
  7. Exame microscópico: Colete e analise imagens usando um microscópio óptico vertical (Tabela de Materiais).

4. Análise por citometria de fluxo

  1. Abra a cavidade abdominal dos camundongos. Extraia os baços com uma pinça e pique em pequenos pedaços de 1,5-2,5 cm em PBS no gelo com uma tesoura. Triture o baço em 10 mL de RPMI-1640 contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) usando um pistão de seringa de 2,5 mL e empurre-o através de um filtro de células de 70 μm para obter uma suspensão de célula única (Tabela de Materiais).
    NOTA: Os baços foram colhidos dos mesmos camundongos na etapa 2.1.
  2. Transfira a suspensão obtida na etapa 4.1 para tubos de 15 mL e lise usando 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos no gelo por 10 min. Lave com RPMI-1640 contendo 2% de FBS, centrifugue a 350 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com RPMI-1640 contendo 2% de FBS.
  3. Conte as células com um contador automático de células (Tabela de Materiais) e ajuste a concentração para 1 x 106 células/mL.
  4. Pipete 100 μL de suspensão celular em tubos de 1,5 mL e incube com 1 μL de anticorpo anti-camundongo CD16/3214 (0,5 mg/mL) por 30 min para bloquear a coloração inespecífica. Lave com RPMI-1640 e centrifugue a 350 x g por 5 min, descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 100 μL de RPMI-1640 contendo 2% de FBS.
  5. Corar com anticorpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) e CD69 (BV674) para células Teff15 por 30 min, 2 μL para cada anticorpo. Corar com anticorpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) e CD62L (PE) para células Tem16 por 30 min, 2 μL para cada anticorpo. Lave com RPMI-1640 e centrifugue a 350 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 350 μL de PBS. Analise a proporção celular usando um citômetro de fluxo e o software associado (Tabela de Materiais).

5. Análise de citocinas por arranjo de esferas citométricas

  1. Use o arranjo de esferas citométricas (Tabela de Materiais) para medir IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, fator de necrose tumoral (TNF)-α e IFN-γ em cérebros de camundongos, métodos descritos abaixo.
  2. Colete o cérebro do rato conforme descrito na etapa 2.1.
  3. Extração de proteína total: Corte e pese 50 mg de tecido cerebral (três cérebros no grupo controle, grupo EAE no estágio de pico e estágio RR). Coloque os cérebros em tubos de 1,5 mL e adicione 500 μL de tampão de lise contendo PMSF, inibidor de protease e inibidores de fosfatase.
  4. Corte os cérebros em pequenos pedaços em torno de 1 mm3, extraia por homogeneizador ultrassônico a 400 W, 5 s ON e 5 s OFF; Repita por 5x. Coloque o tubo no gelo por 10 min, centrifugue a 12000 x g por 5 min e colete o sobrenadante (Tabela de Materiais).
  5. Prepare os padrões de citocinas Th1 / Th2 / Th17 do camundongo conforme descrito abaixo.
    1. Abra um frasco de padrões Th1 / Th2 / Th17 de camundongo liofilizado. Transfira os padrões para um tubo cônico de polipropileno de 15 mL. Rotule a parte superior do tubo como padrão.
    2. Reconstituir os padrões em 2,0 mL de diluente de ensaio. Deixe o padrão reconstituído se equilibrar por 15 min à temperatura ambiente. Misture delicadamente a proteína reconstituída pipetando.
    3. Rotule os tubos de 12 mm x 75 mm e organize-os na seguinte ordem de diluição: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256. Pipetar 300 μL de diluente de ensaio em cada tubo marcado.
    4. Efectuar diluições em série: Transferir 300 μL do padrão superior para o tubo de diluição 1:2 e homogeneizar por pipetagem. Continue as diluições em série transferindo 300 μL do tubo 1:2 para o tubo 1:4 e assim por diante até o tubo 1:256. Preparar um tubo de 12 mm x 75 mm contendo apenas o diluente de ensaio para servir de controlo negativo de 0 pg/ml.
      NOTA: Misture bem pipetando. Não faça vórtices para evitar que o acoplamento de anticorpos nas microesferas caia.
    5. Para misturar as esferas de captura de citocinas Th1 / Th2 / Th17 de camundongo, prepare 19 tubos, incluindo padrões com 3 amostras em cada grupo (grupo controle, grupo EAE em estágio de pico e estágio RR) para o experimento. Vortex a suspensão do cordão de captura vigorosamente por 5 s antes de misturar. Adicione 190 μL de cada cordão de captura em um único tubo e rotule-o como grânulos de captura mistos. Vortex a mistura de contas completamente.
      NOTA: Os grânulos conjugados com anticorpos se assentarão fora da suspensão com o tempo. É necessário vórtice o frasco antes de tomar uma alíquota de suspensão de cordão.
    6. Para realizar o ensaio, vortex os grânulos de captura da mistura. Adicione 50 μL de grânulos a todos os tubos de ensaio. Adicione 50 μL de diluições padrão de citocinas Th1 / Th2 / Th17 de camundongo aos tubos de controle, conforme na Tabela 1.
    7. Adicione 50 μL do reagente de detecção de PE Th1 / Th2 / Th17 do camundongo a todos os tubos de ensaio. Incube os tubos de ensaio por 2 h em temperatura ambiente e proteja-os da luz. Adicione 1 mL de tampão de lavagem a cada tubo de ensaio e centrifugue a 200 x g por 5 min. Aspirar e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo de doseamento.
    8. Adicione 300 μL de tampão de lavagem a cada tubo de ensaio para ressuspender o grânulo de grânulos. Analise os dados de citocinas Th1 / Th2 / Th17 do camundongo usando o software FCAP Array (Tabela de Materiais).

  

Resultados

Avaliação de escores clínicos
Como mostrado na Figura 1, os camundongos do grupo controle não apresentaram nenhum sintoma clínico. Os camundongos do grupo EAE, que foram imunizados com MOG35-55, apresentaram paralisia da cauda aproximadamente 12 dias após a imunização. No dia 16, os sintomas atingiram paralisia completa dos membros posteriores (definida como estágio de pico, pico). Depois disso, os sintomas foram gradualmente rem...

Discussão

A SM é a doença desmielinizante autoimune mais prevalente do SNC, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo17. O EAE é o modelo animal típico para simular as características clínico-patológicas da SM18. Estudos têm demonstrado que indivíduos com SM apresentam comprometimento cognitivo e outras incapacidades devido à degeneração de axônios e neurônios no SNC 19,20,21.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Ningxia (2022AAC03601 e 2023AAC02087) e pela Fundação de Pesquisa da Universidade Médica de Ningxia (XM2019052). Obrigado pelo apoio do Centro de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica da Universidade Médica de Ningxia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machine evaporatorNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.792632
70 μm cell strainerXIYAN Co.,Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103128
APC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100616
Automatic cell counterJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend101303
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD69 AntibodyBiolegend104532
BV786 Rat Anti-Mouse CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue&Cell Protein Extraction KitShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. SLCH4887
DehydratorDIAPATHDonatello
Disposable sterilized syringe (1 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (2.5 mL)Yikang Group210820
Disposable sterilized syringe (5 mL)Yikang Group210820
Dyeing machineDIAPATHGiotto
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EthanolSCRC100092683
Fetal Bovine SerumProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Glass slideServicebioG6004
HE dye solution setServicebioG1003
Hematoxylin-Eosin solutionServicebioG1002
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Imaging systemNikonNIKON DS-U3
Luxol fast blue staining kitServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Neutral gumSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Pathology slicerLeicaRM2016
Pertussis Toxin from Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Pipette 0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
Pipette 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
Pipette 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.PM150110
Tee valveGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Tissue spreaderZhejiang Kehua Instrument Co.,LtdKD-P
Upright optical microscopeNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418

Referências

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