توليف وفحص مثبطات استشعار النصاب الضمي

Summary

مركبات ثيوفين سلفوناميد هي مثبطات قوية ومحددة لمنظمات استشعار النصاب الضمي LuxR / HapR التي تمنع نشاطها في الجسم الحي ، وبالتالي تمنع نسخ الجينات من أجل الفوعة والحركة والأغشية الحيوية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تصنيع هذه المركبات ، ونمذجتها في السيليكو ، وفحصها في الجسم الحي للنشاط ضد LuxR / HapR.

Abstract

تكتشف البكتيريا أعداد السكان المحليين باستخدام استشعار النصاب ، وهي طريقة للتواصل بين الخلايا والخلايا تستخدم على نطاق واسع للتحكم في السلوكيات البكتيرية. في أنواع الضمة ، تتحكم منظمات استشعار النصاب الرئيسية LuxR / HapR في مئات الجينات المستشعرة للنصاب ، والتي يؤثر الكثير منها على الفوعة والتمثيل الغذائي والحركة وغير ذلك. ثيوفين سلفوناميدات هي مثبطات قوية ل LuxR / HapR التي تربط جيب الليجند في عوامل النسخ هذه وتمنع التعبير الجيني لاستشعار النصاب في نهاية المطاف. كانت هذه الفئة من المركبات بمثابة أساس لتطوير مجموعة من الإجراءات البسيطة والقوية والتعليمية لطلاب الجامعات لاستيعاب مهاراتهم في الكيمياء والبيولوجيا باستخدام نموذج CURE: تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة. يتم وصف البروتوكولات المحسنة التي تتكون من ثلاث مراحل تعليمية في منصة تكرارية ومتعددة التخصصات لإشراك الطلاب في علاج لمدة عام: (1) تصميم وتوليف مثبطات جزيئات صغيرة جديدة بناء على نواة ثيوفين سلفوناميد ، (2) استخدام النمذجة الهيكلية للتنبؤ بتقارب الارتباط بالهدف ، و (3) فحص المركبات للفعالية في المقايسات الميكروبيولوجية ضد بروتينات Vibrio LuxR / HapR محددة. يتنبأ اختبار المراسل الموصوف الذي تم إجراؤه في الإشريكية القولونية بنجاح بفعالية المركبات ضد البروتينات المستهدفة في أنواع الضمة الأصلية.

Introduction

تستشعر البكتيريا الكثافة السكانية ونوع الخلايا القريبة باستخدام عملية اتصال بين الخلية والخلية تسمى استشعار النصاب (QS)¹. تستخدم مجموعات متنوعة من البكتيريا QS للتحكم في السلوكيات المختلفة ، مثل الحركة ، وتكوين الأغشية الحيوية ، وإفراز عامل الفوعة ، والمزيد. تختلف البروتينات والإشارات المشاركة في QS اختلافا كبيرا بين البكتيريا. في أنواع الضمة ، يستخدم نظام إشارات QS في الغالب مستقبلات الهيستيدين كيناز الهجينة المرتبطة بالغشاء والتي تتعرف على إشارات جزيئية صغيرة محددة تسمى autoduccers² (الشكل 1). تتحكم هذه المستقبلات في تدفق الفوسفات عبر النظام إلى م....

Protocol

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. تصميم وتوليف مكتبات ثيوفين سلفوناميد

ملاحظة: يتم تصنيع مثبطات ثيوفين سلفوناميد مثل 3-فينيل-1- (ثيوفين-2-يلسلفونيل) -1 H-بيرازول (PTSP) عبر التكثيف المعزز بالقاعدة من خطوة^{واحدة 8,9} ، كما هو موضح في الشكل 2. لتصميم مكتبات مركبة جديدة للدراسة ، يجب على الباحثين شراء الأمينات المناسبة وكلوريد السلفونيل واتباع الخطوات الملخصة أدناه. إذا كان هيكل الأمين يختلف اختلافا كبيرا عن مشتق ....

النتائج

كنتائج تمثيلية ، تم تضمين البيانات من ثلاثة مركبات ثيوفين سلفوناميد تم تصنيعها من قبل الطلاب الجامعيين للمركبات 1A و 2B و 3B (الشكل 5A-C ؛ الموصوف بالتفصيل في Newman et al.⁹). تم اختبار كل مركب في سلالة الإشريكية القولونية ال?.......

Discussion

تم تطوير هذا العلاج في الأصل كبروتوكول مختصر من مرحلتين وثلاثة أسابيع (التصميم / التوليف والفحص) وتم تنفيذه في خمسة فصول دراسية كجزء من دورة المختبر العضوي العليا⁸. منذ التقرير الأصلي ، تمت إضافة وحدة النمذجة الحاسوبية ، وتم تحسين اختبار الإشريكية القولون?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract