Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مركبات ثيوفين سلفوناميد هي مثبطات قوية ومحددة لمنظمات استشعار النصاب الضمي LuxR / HapR التي تمنع نشاطها في الجسم الحي ، وبالتالي تمنع نسخ الجينات من أجل الفوعة والحركة والأغشية الحيوية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تصنيع هذه المركبات ، ونمذجتها في السيليكو ، وفحصها في الجسم الحي للنشاط ضد LuxR / HapR.

Abstract

تكتشف البكتيريا أعداد السكان المحليين باستخدام استشعار النصاب ، وهي طريقة للتواصل بين الخلايا والخلايا تستخدم على نطاق واسع للتحكم في السلوكيات البكتيرية. في أنواع الضمة ، تتحكم منظمات استشعار النصاب الرئيسية LuxR / HapR في مئات الجينات المستشعرة للنصاب ، والتي يؤثر الكثير منها على الفوعة والتمثيل الغذائي والحركة وغير ذلك. ثيوفين سلفوناميدات هي مثبطات قوية ل LuxR / HapR التي تربط جيب الليجند في عوامل النسخ هذه وتمنع التعبير الجيني لاستشعار النصاب في نهاية المطاف. كانت هذه الفئة من المركبات بمثابة أساس لتطوير مجموعة من الإجراءات البسيطة والقوية والتعليمية لطلاب الجامعات لاستيعاب مهاراتهم في الكيمياء والبيولوجيا باستخدام نموذج CURE: تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة. يتم وصف البروتوكولات المحسنة التي تتكون من ثلاث مراحل تعليمية في منصة تكرارية ومتعددة التخصصات لإشراك الطلاب في علاج لمدة عام: (1) تصميم وتوليف مثبطات جزيئات صغيرة جديدة بناء على نواة ثيوفين سلفوناميد ، (2) استخدام النمذجة الهيكلية للتنبؤ بتقارب الارتباط بالهدف ، و (3) فحص المركبات للفعالية في المقايسات الميكروبيولوجية ضد بروتينات Vibrio LuxR / HapR محددة. يتنبأ اختبار المراسل الموصوف الذي تم إجراؤه في الإشريكية القولونية بنجاح بفعالية المركبات ضد البروتينات المستهدفة في أنواع الضمة الأصلية.

Introduction

تستشعر البكتيريا الكثافة السكانية ونوع الخلايا القريبة باستخدام عملية اتصال بين الخلية والخلية تسمى استشعار النصاب (QS)1. تستخدم مجموعات متنوعة من البكتيريا QS للتحكم في السلوكيات المختلفة ، مثل الحركة ، وتكوين الأغشية الحيوية ، وإفراز عامل الفوعة ، والمزيد. تختلف البروتينات والإشارات المشاركة في QS اختلافا كبيرا بين البكتيريا. في أنواع الضمة ، يستخدم نظام إشارات QS في الغالب مستقبلات الهيستيدين كيناز الهجينة المرتبطة بالغشاء والتي تتعرف على إشارات جزيئية صغيرة محددة تسمى autoduccers2 (الشكل 1). تتحكم هذه المستقبلات في تدفق الفوسفات عبر النظام إلى منظم استجابة ينسخ الحمض النووي الريبي الصغير. يغير إنتاج sRNAs إنتاج منظم استشعار النصاب الرئيسي ، والذي يتم تعريفه على أنه مجموعة محفوظة من البروتينات تسمى مجتمعة LuxR / HapR3. وبالتالي ، عند كثافة الخلايا المنخفضة ، يتحلل ترميز mRNA LuxR / HapR عن طريق استهداف sRNA ، وعند كثافة الخلايا العالية ، يتم إنتاج بروتين LuxR / HapR بمستويات قصوى (تمت مراجعته في Ball et al.3).

تنتمي مجموعة بروتينات LuxR / HapR إلى مجموعة كبيرة من بروتينات TetR ، والتي يتم تعريفها من خلال وجود حلزون يتحول إلى حلزون في مجال ربط الحمض النووي ، وتشكيل متجانس وظيفي ، وعادة ما يتم تضمين مجال ربط ليجند4. تتناسب بروتينات Vibrio LuxR / HapR مع جميع هذه المعايير ، على الرغم من أنه لم يتم تحديد الرباط بعد. يتحكم بروتين LuxR / HapR في جميع أنواع الضمة المدروسة في العديد من سلوكيات المصب ، ومن المعروف أن العديد منها مهم في التسبب في المرض: إنتاج الأغشية الحيوية ، والبروتياز ، والسموم الخلوية ، والهيموليزين ، والإفراز من النوع الثالث ، ومجمعات إفراز النوع السادس ، وأكثر منذلك 3. يؤدي حذف بروتين LuxR / HapR إلى انخفاض أو فقدان الفوعة في الأنظمة المضيفة5،6،7 ، مما يؤدي إلى فرضية أن تثبيط هذه البروتينات هو استراتيجية قابلة للتطبيق لمواجهة تطور المرض. تسبب أنواع الضمة مرض الضمة في الكائنات البحرية ، بما في ذلك الأسماك والمحار والشعاب المرجانية ، وكذلك في البشر الذين يتلامسون مع أنواع معينة أو يتناولونها.

حددت الأبحاث السابقة لوحة من مركبات ثيوفين سلفوناميد التي ترتبط على وجه التحديد بمجال ربط الليجند لبروتينات LuxR / HapR في أنواع متعددة من الضمة لمنع وظيفتها5،8،9 (الشكل 1). باستخدام شاشة مراسل في الإشريكية القولونية ، تم تحديد المركبات واختبارها لاحقا في الضمة الأصلية ، والتي أظهرت ارتباطا كبيرا بين التأثير في الإشريكية القولونية غير المتجانسة والفعالية في الضمة9. هذه المركبات سهلة التركيب في خطوة واحدة ، مما يجعلها مثالية لتوليف المكتبة الصغيرة في سياق دورة مختبر البيولوجيا الكيميائية. تم الإبلاغ سابقا عن تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة التدريبية لمدة ثلاثة أسابيع (CURE) تم تصميمها حول هذه السقالة الجزيئية8. تم تحسين هذه الوحدة التي تستغرق ثلاثة أسابيع وتبسيطها وتوسيعها في هذا العلاج الذي يستمر لمدة عام والمصمم لاستهداف تثبيط بروتينات LuxR / HapR في أنواع الضمة المتنوعة.

Protocol

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. تصميم وتوليف مكتبات ثيوفين سلفوناميد

ملاحظة: يتم تصنيع مثبطات ثيوفين سلفوناميد مثل 3-فينيل-1- (ثيوفين-2-يلسلفونيل) -1 H-بيرازول (PTSP) عبر التكثيف المعزز بالقاعدة من خطوةواحدة 8,9 ، كما هو موضح في الشكل 2. لتصميم مكتبات مركبة جديدة للدراسة ، يجب على الباحثين شراء الأمينات المناسبة وكلوريد السلفونيل واتباع الخطوات الملخصة أدناه. إذا كان هيكل الأمين يختلف اختلافا كبيرا عن مشتق البيرازول العطري ، فقد يلزم تحديد ظروف تفاعل بديلة من خلال البحث في الأدبيات. هذا الإجراء قوي ، كما عملت قواعد مثل هيدروكسيد الصوديوم وثلاثي إيثيل أمين والبيريدين بشكل جيد. إذا تم تنفيذ ذلك في دورة تدريبية ، فقد يتم منح الطلاب حرية اختيار الإجراء الخاص بهم مع نتائج إيجابية محتملة.

  1. توليف وعزل PTSP
    ملاحظة: يمكن إكمال ذلك في فترة مختبر واحدة مدتها 3 ساعات.
    1. قم بإذابة 822 مجم من فينيل بيرازول (5.7 مليمول من الأمين ، 1.5 مكافئ) في 15 مل من رباعي هيدروفوران في دورق دائري القاع سعة 50 مل مع قضيب تحريك.
    2. أضف ببطء 306 مجم من هيدريد الصوديوم (60٪ في الزيت ، 7.65 مليمول ، 2 مكافئ) لإنشاء تعليق. دع هذا التعليق يحرك على طبق تحريك لمدة 10 دقائق.
    3. في قنينة ، تحضير محلول من كلوريد ثيوفين سلفونيل (3.82 مليمول من كلوريد السلفونيل ، 1 مكافئ) في 5 مل من THF.
    4. أضف محلول كلوريد السلفونيل المحضر في الخطوة 1-1-3 إلى المعلق المحضر في الخطوة 1-1-2 واترك المعلق الناتج يحرك لمدة 30 دقيقة إضافية.
    5. أضف 20 mL من DI الماء إلى خليط التفاعل في الدورق المستدير القاع 50 mL.
    6. انقل جميع محتويات دورق التفاعل باستثناء قضيب التحريك إلى قمع فصل 250 مل10.
    7. أضف 20 مل من أسيتات الإيثيل (EtOAc) إلى قمع الفصل ورجه.
    8. أزيلي الطبقة السفلية (المائية) واتركيها جانبا.
    9. قم بإزالة الطبقة العلوية (العضوية) واتركها جانبا في دورق Erlenmeyer سعة 200 مل.
    10. أعد الطبقة المائية إلى قمع الفصل واستخلصها ب 20 مل من أسيتات الإيثيل.
    11. كرر الخطوتين 1.1.8 و1.1.9.
    12. أعد الطبقات العضوية المدمجة إلى القمع الفاصل واغسلها ب 20 مل من كلوريد الصوديوم المشبع (محلول ملحي).
    13. أزيلي الطبقة السفلية (المائية) واتركيها جانبا.
    14. صفي الطبقة العلوية (العضوية) مرة أخرى في دورق Erlenmeyer.
    15. جفف الطبقات العضوية المدمجة فوق MgSO4 في دورق Erlenmeyer وقم بالتصفية في دورق دائري القاع سعة 250 مل باستخدام ورق الترشيح النوعي10.
    16. قم بإزالة المذيب العضوي على المبخر الدوار.
  2. قم بتحليل خليط التفاعل الخام بمقدار 1H NMR للتأكد من أن المنتج قد شكل10.
    ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لهذه الخطوة على مستوى راحة الطالب باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
  3. تنقية المنتج عن طريق كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا (10: 1 الهكسانات: خلات الإيثيل)10.
    ملاحظة: يمكن إكمال ذلك في فترة مختبر واحدة مدتها 3 ساعات.
  4. تميز المنتج الطيفية.
    ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لهذه الخطوة على مستوى راحة الطالب باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
    ملاحظة: بيانات توصيف 3-فينيل-1- (ثيوفين-2-يلسلفونيل)-1 H-بيرازول (PTSP)10:
    1H NMR (400 ميجاهرتز ، CDCl 3 ): δ 8.11 (d ، J = 2.8 هرتز ، 1H) ، 7.88 - 7.79 (م ، 3H) ، 7.68 (يوم ، J = 5.0 ، 1.4 هرتز ، 1H) ، 7.44 - 7.31 (م ، 3 ساعات) ، 7.07 (يوم ، J = 5.0 ، 3.9 هرتز ، 1 ساعة) ، 6.71 (د ، J = 2.8 هرتز ، 1 ساعة).
    13C الرنين المغناطيسي النووي (101 ميجاهرتز ، CDCl 3 ): δ 157.17 ، 136.84 ، 135.40 ، 135.36 ، 132.55 ، 131.28 ، 129.36 ، 128.72 ، 127.79 ، 126.47 ، 106.90.
    نظام إدارة الموارد البشرية (ESI): محسوبة ل C13H10O2N2NaS2 [M + Na +]: 313.0076. وجدت: 313.0078.

2. النمذجة الهيكلية للتنبؤ بارتباط ثيوفين سلفوناميدات بمنظم Vibrio LuxR / HapR

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الإصدار المستند إلى الويب من AutoDock Vina المسمى Webina11 لإرساء مثبطات الجزيئات الصغيرة (PTSP في هذه الحالة) في جيب ربط الليجند لمتماثل LuxR / HapR المسمى SmcR من Vibrio vulnificus12. نتائج هذا البروتوكول هي (1) تقارب الربط المحسوب و (2) ملف هيكل يمكن فتحه في PyMol أو برنامج ذي صلة لتصور تفاعلات البروتين الليجند. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي جزيء صغير وأي بروتين به جيب ربط يجند. يستغرق الأمر دقائق للرسو في SmcR لأن منطقة البحث عن هذا المستقبل محددة أدناه. إذا كانت منطقة البحث بحاجة إلى تحديد مستقبل جديد (الخطوات 2.15-2.20) ، فيمكن إكمال ذلك في فترة مختبر واحدة مدتها 3 ساعات. بمجرد تحديد منطقة البحث ، ستستغرق عمليات الإرساء اللاحقة دقائق.

  1. قم بتنزيل أدوات الإرساء التلقائي. حدد الملف المناسب لنظام التشغيل وقم بتثبيته على الكمبيوتر.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول إصدار يستند إلى ويب من AutoDock Vina. يمكن أيضا إجراء الإرساء محليا إذا تم تثبيت هذا البرنامج (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
  2. قم بتنزيل بنية apo SmcR.
  3. انتقل إلى بنك بيانات البروتين.
  4. في شريط البحث، أدخل معرف PDB 3KZ9.
  5. انقر فوق تنزيل الملفات من القائمة المنسدلة باتجاه الزاوية اليمنى العليا من الصفحة وحدد تنسيق pdb .
  6. بعد تنزيل الملف ، احفظه في مجلد جديد مخصص لأعمال الإرساء.
  7. إنشاء ملف بنية .mol لمثبط الجزيء الصغير (PTSP).
  8. انتقل إلى molview وانقر على أيقونة سلة المهملات لإزالة الهيكل الموجود هناك.
  9. ارسم PTSP في نافذة الهيكل.
  10. انقر على 2D إلى 3D.
  11. انقر فوق أدوات → تصدير ملف → MOL.
  12. سيتم تنزيل ملف بعنوان "Molview.mol" على الكمبيوتر. امنح الملف اسما منطقيا واحفظه في المجلد الذي يحتوي على ملف pdb البروتيني.
  13. حدد منطقة البحث.
  14. حدد المنطقة في Webina على أنها جيب ربط البروتين (SmcR) لتسهيل الالتحام في المنطقة الصحيحة.
    ملاحظة: يتم توفير إحداثيات SmcR وإنشاؤها باستخدام البروتوكول التالي. إذا كان SmcR قيد الاستخدام ، فيمكن تخطي الخطوات 2.15-2.20. يمكن تكييف البروتوكول مع أي بروتين له جيب ربط ليجند معروف. الإحداثيات: center_x = 17 ، center_y = 40 ، center_z = 56 ، size_x = 12 ، size_y = 12 ، size_z = 12.
  15. في أدوات AutoDock ، انقر فوق File → Read Molecule وافتح ملف بروتين pdb الذي تم تنزيله في الخطوة 2.5.
  16. انتقل إلى لوحة القيادة وانقر على السهم الأزرق بجوار اسم البروتين. سيؤدي ذلك إلى إظهار قائمة السلاسل. انقر على السهم الأزرق بجوار إحدى سلاسل البروتين.
  17. لتسليط الضوء على الأحماض الأمينية في جيب الربط ، ابحث عن الأحماض الأمينية ذات الأهمية في القائمة التي ظهرت. بجانب الحمض الأميني ، انتقل إلى المثلث في عمود Cl (اللون) في أقصى اليمين. انقر على المثلث وحدد بواسطة قوس قزح.
    ملاحظة: استخدم هذه الطريقة لتسليط الضوء على الأحماض الأمينية التالية:12 Phe75 ، Phe78 ، Leu79 ، Ile96 ، Met100 ، Trp114 ، Phe129 ، Asn133 ، Gln137 ، Val140 ، Ala163 ، Phe166 ، His167 ، Cys170 (إذا كان Met100 مفقودا ، فيمكن تخطي ذلك).
  18. بعد ذلك ، انقر فوق الشبكة → GridBox. يجب أن يظهر مربع فوق بنية البروتين بوجه أحمر وأخضر وأزرق. قبل إجراء أي تغييرات ، قم بتغيير التباعد (angstrom) إلى 1. سيضمن ذلك تغيير حجم المربع بشكل صحيح للخطوات التالية.
    1. بعد ذلك ، قم بتغيير أقراص مربع الشبكة المركزية <الإزاحة> لترجمة المربع في اتجاهات x و y و z لوضعه فوق الأحماض الأمينية المميزة. انقر واسحب البروتين لتدوير الهيكل في ثلاثة أبعاد.
      ملاحظة: سيساعد هذا في التأكد من أن الصندوق في الموضع الصحيح. إذا لزم الأمر ، استخدم الأقراص الثلاثة العلوية لعدد النقاط لتغيير حجم المربع.
  19. بمجرد تعيين موضع الصندوق وأبعاده ، انقر فوق ملف → إغلاق حفظ الحالي.
  20. في القائمة ، انقر فوق إخراج → الشبكة → حفظ GPF. قم بتسمية الملف واحفظه في نفس المجلد مثل ملفي الهيكل. يحتوي ملف GPF هذا على إحداثيات المربع.
  21. قم بإجراء "الإرساء" في Webina لتوليد طاقة ربط محسوبة.
  22. افتح المجلد الذي يحتوي على ملف ليجند .mol وملف البروتين .pdb. يتطلب Webina ملفات .pdbqt ، وسيقوم بتحويل الملف.
  23. انتقل إلى ويبينا.
  24. المستقبل: اسحب فوق الملف الذي تم تنزيله من pdb المسمى 3kz9.pdb. انقر فوق إضافة ذرات الهيدروجين ، وانقر فوق تحويل. انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة التالية للعمل مع مونومر.
  25. Ligand: اسحب فوق ملف .mol ل PTSP (أو مثبط جزيء صغير آخر). تأكد من عدم تحديد مربعات وانقر فوق تحويل. اترك "الوضع الصحيح" فارغا وانتقل لأسفل إلى مربع الإرساء. أدخل معلمات المربع المناسبة (إما تلك المذكورة أعلاه ل SmcR أو مجموعة تم إنشاؤها بواسطة البروتوكول في الخطوات 2.15-2.20 لبروتين مختلف).
  26. انقر فوق بدء Webina وانتظر.
  27. سيتم الإبلاغ عن سلسلة من طاقات الربط المحسوبة [التقارب (كيلو كالوري / مول)] مباشرة أسفل تصور الجزيء الراسي. تأكد من أن القيمة الأولى هي الأكثر سلبية.
  28. لتصور الربيطة الراسية في pymol أو برنامج آخر مشابه ، قم بتنزيل ملف Output PDBQT بالنقر فوق زر التنزيل المناسب. هذا الملف هو مجرد ligand (PTSP) في إحداثيات الإرساء.
  29. تصور مجمع ligand-SmcR الراسية في PyMol13.
    1. قم بتنزيل وفتح PyMol.
      ملاحظة: قد يحصل الطلاب والمعلمون بدوام كامل على ترخيص PyMol مجانا. عندما يطلب منك الحصول على ترخيص بعد بدء تشغيل PyMol لأول مرة ، انقر فوق شراء الترخيص. حدد الطالب / المعلم.
    2. افتح ملف pdb المسمى 3kz9.pdb.
    3. افتح ملف إخراج pdbqt الذي تم إنشاؤه بواسطة Webina.
    4. تصور أفضل تشكيل (الذي يحتوي على أدنى تقارب ملزم) من خلال النقر على أسهم التأشير الصغيرة في أسفل يمين شاشة PyMol. سيكون التشكيل الأول هو الأكثر ملاءمة وسيظهر عند فتح الملف.
    5. تعامل مع البروتين مع الرباط الراسية في PyMol باستخدام الأوامر القياسية14.
      ملاحظة: قارنت الدراسة السابقة التي أجراها Newman et al. الصلات الملزمة المتوقعة للعديد من المركبات التي حددتها Webina إلى المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي 9. تعمل هذه الصلات الملزمة كمراجع للمركبات التي من المحتمل أن تكون مثبطات جيدة ذات تقارب عال (والتي ترتبط بانخفاض أرقام السعرات الحرارية / مول) لجيب الربط. يتم تضمين مثال على بيانات إخراج Webina في الشكل 3A ، B لربط PTSP في جيب SmcR.

3. التقييم البيولوجي للثيوفين سلفوناميدات في تثبيط استشعار النصاب

ملاحظة: يتم وصف الإجراء الخاص بفحص بروتين Vibrio campbellii LuxR هنا. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا الإجراء للاستخدام مع أي من بروتينات Vibrio LuxR / HapR ، وكلها متوفرة على البلازميدات المكررة خارجيا والمتوافقة مع بلازميد المراسل pJV0649. يتم إجراء اختبار "الشاشة الحمراء والخضراء" في خلفية بكتيرية غير متجانسة باستخدام خلايا الإشريكية القولونية التي تحتوي على البلازميدات. يتوفر بلازميد تعبير LuxR / HapR (يمنح مقاومة الكانامايسين) للتعبير عن جينات LuxR المختلفة (الشكل 4 أ). يشفر بلازميد pJV064 (الذي يمنح مقاومة الكلورامفينيكول) جين gfp تحت سيطرة مروج منشط LuxR وجين mCherry تحت سيطرة مروج مكبوت LuxR (الشكل 4 أ). تم اختيار كلا المروجين بسبب تحديدهما على أنهما جينات منظمة من LuxR مع تغييرات كبيرة في التعبير في الجسم الحي15. تم نشر سلالات LuxR / HapR E. coli و plasmid pJV064 سابقا 9,15.

  1. تحضير الوسائط السائلة: تحضير 1 لتر من وسط LB.
    1. تزن 10 جم من كلوريد الصوديوم و 10 جم من البكتوتريبتون و 5 جم من خلاصة الخميرة.
    2. امزج المكونات في دورق أو أسطوانة مدرجة باستخدام لوح التقليب.
    3. ارفع الحجم الكلي إلى 1 لتر باستخدام المخبار المدرج.
    4. إذا رغبت في ذلك ، قسمة إلى 100 مل لكل زجاجة قبل التعقيم.
    5. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة لكل 1 لتر من الوسائط. بدلا من ذلك ، إذا لم يكن الأوتوكلاف متاحا ، فيمكن استخدام وعاء فوري16.
  2. التلقيح بالسلالة (اليوم 1)
    1. أضف المضادات الحيوية إلى وسط LB عند التركيزات النهائية للكاناميسين (40 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (10 ميكروغرام / مل).
    2. القسمة 5 مل من LB / Kan40 / CM10 المتوسطة في أنابيب اختبار معقمة مع أغطية.
    3. تلقيح سلالات الإشريكية القولونية من مخزون المجمد: ثقافة الإشريكية القولونية التي تعبر عن LuxR / HapR و pJV064 plasmid (LuxR +) 9,15 ؛ E. الإشريكية القولونية ثقافة مكافحة النواقل الفارغة وبلازميد pJV064 (LuxR-)9,15.
    4. هز الثقافة بين عشية وضحاها عند 275 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  3. فحص ثيوفين سلفوناميدات (اليوم 2)
    1. تزن ~ 30 ملغ من المركب. أعد التعليق إلى 100 مللي متر في DMSO ودوامة للخلط. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزون 10 مللي متر.
    2. امزج 20 ميكرولتر من مخزون 100 مللي متر مع 180 ميكرولتر من DMSO لتخفيفه (1:10) لإنتاج مخزون عامل 10 مللي مول. دوامة لخلط.
    3. قم بتخفيف ثقافة LuxR + ومزارع LuxR (1: 100) في 10 مل من وسائط LB / Kan / CM إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل ودوامة لفترة وجيزة للخلط.
    4. استخدم صفيحة 96 بئرا سوداء ، واضحة القاع ، معقمة للفحص.
    5. قم بإعداد سلسلة تخفيف لجميع الأعمدة. يتم تضمين رسم تخطيطي لسلسلة التخفيف ذات 4 أضعاف كمرجع (الشكل 4B).
      ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة رقمية متعددة القنوات لهذه العملية. هذه الطريقة مخصصة لسلسلة تخفيف 4 أضعاف (1: 4). ومع ذلك ، يمكن استخدام سلسلة تخفيف مختلفة (على سبيل المثال ، 1:10 ، 1:5).
      1. تمتزج ماصة 200 ميكرولتر من مزرعة LuxR + في صفيحة 96 بئرا في الصف A ، 1-6 (الشكل 4B ؛ أخضر).
      2. ماصة 200 ميكرولتر من مزيج LuxR- ثقافة في لوحة 96 بئر في الصف A ، 7-12 (الشكل 4B ؛ برتقالي).
      3. تمتزج ماصة 150 ميكرولتر من مزرعة LuxR + في صفيحة 96 بئرا في الصفوف B-E ، 1-6 (الشكل 4B ؛ أخضر).
      4. تمتزج ماصة 150 ميكرولتر من LuxR- ثقافة في صفيحة 96 بئرا في الصفوف B-E ، 7-12 (الشكل 4B ؛ برتقالي).
      5. أضف 2 ميكرولتر من المركب أو DMSO إلى كل بئر من الصف A وفقا للشكل 4B.
      6. لكل عمود ، قم بالسحب لأعلى ولأسفل 3 مرات ، ثم انقل 50 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B ، في نفس العمود.
      7. كرر الخلط والسحب للصفوف B ، C ، D ، E. بعد خلط الصف E ، قم بإزالة 50 ميكرولتر ووضعها في النفايات. في النهاية ، يجب أن يكون لدى المرء 150 ميكرولتر في كل بئر.
    6. غطي اللوحة بشريط صغير يسهل اختراقه.
    7. احتضن اللوحة عن طريق الهز عند 275 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية طوال الليل لمدة 16-18 ساعة.
    8. قم بقياس التألق والكثافة البصرية للوحات الفحص (اليوم 3).
      1. قم بإزالة الشريط بعناية ، ولا تسكب السائل من الآبار.
      2. على قارئ اللوحة ، اقرأ الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) و GFP و mCherry.
        ملاحظة: يوصى بكسب محدد لكل من قنوات التألق لتمكين المقارنات بين المقايسات.
    9. سجل البيانات كمضان طبيعي لكل خلية: GFP / OD600 و mCherry / OD600.
    10. ارسم البيانات ، كما هو موضح في الشكل 5 ، لتوضيح نتائج عنصر تحكم DMSO مقارنة بعينات الاختبار.

4. غسل لوحات الفحص السوداء لإعادة استخدامها

  1. نقع لوحات في التبييض.
    1. قم بتسمية دورق بلاستيكي سعة 1 لتر على أنه "نفايات بيولوجية". قم بتفريغ السائل من الألواح في حاوية النفايات هذه (نظف بعناية أي قطرات بنسبة 70٪ EtOH). اشطف الألواح بماء DI من زجاجة الرش فوق النفايات وأفرغها فيها.
    2. قم بتسمية دورق بلاستيكي آخر سعة 1 لتر على أنه "مبيض 30٪". ضع الألواح / الأغطية في هذه الحاوية وقم بتغطيتها بتبييض 30٪. لف الجزء العلوي بورقة بلاستيكية وقم بوزن الألواح بصندوق طرف أو شيء مشابه. اتركيه مغمورا في محلول التبييض طوال الليل.
  2. شطف ونقع في الإيثانول.
    1. اشطف الألواح جيدا بماء DI في الحوض حتى لا يبقى أي مبيض. تفريغ أي مياه متبقية من الآبار في الحوض.
    2. أضف 70٪ EtOH إلى جميع الآبار والأغطية باستخدام زجاجة رذاذ. دع الألواح تجلس في وضع مستقيم مع الغطاء في الأعلى ولكن منحرفة حتى يتبخر EtOH ، لكن لا شيء يقع في الآبار. دع اللوحة تجلس طوال الليل.
  3. اترك الألواح حتى تجف.
    1. تخلص من أي EtOH متبقية.
    2. اقلب الطبق على منشفة ورقية واترك بقية EtOH يتبخر. اترك الألواح بهذه الطريقة في غطاء الدخان. ستكون اللوحات جاهزة للاستخدام التالي.

النتائج

كنتائج تمثيلية ، تم تضمين البيانات من ثلاثة مركبات ثيوفين سلفوناميد تم تصنيعها من قبل الطلاب الجامعيين للمركبات 1A و 2B و 3B (الشكل 5A-C ؛ الموصوف بالتفصيل في Newman et al.9). تم اختبار كل مركب في سلالة الإشريكية القولونية ال?...

Discussion

تم تطوير هذا العلاج في الأصل كبروتوكول مختصر من مرحلتين وثلاثة أسابيع (التصميم / التوليف والفحص) وتم تنفيذه في خمسة فصول دراسية كجزء من دورة المختبر العضوي العليا8. منذ التقرير الأصلي ، تمت إضافة وحدة النمذجة الحاسوبية ، وتم تحسين اختبار الإشريكية القولون?...

Disclosures

تكشف JVK و LCB عن المصالح المالية في Quornix، LLC ، والتي قد تستفيد من نتائج الأبحاث على مركبات ثيوفين سلفوناميد.

Acknowledgements

تم دعم البحث المبلغ عنه في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R35GM124698 إلى JVK. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-thiophensulfonyl chlorideAmbeedA258464
3-Phenyl-1H-pyrazoleAmbeedA10440198%
96-well clear bottom black platesUSA Scientific5665-5090Q96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case 
Autodock Toolshttp://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vinahttps://vina.scripps.edu 
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetateFisher ScientificAA31344M4Reagent grade
hexanesFisher ScientificH291
Kanamycin
magnesium sulfateFisher ScientificM65-500Anhydrous
Microporous FilmUSA Scientific2920-1010Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molviewmolview.org
NaCl
Protein Databankhttps://www.rcsb.org/
Pymolhttps://pymol.org/2/
Qualitative filter paperFisher Scientific09-805-342Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gelSorbtech30930M-25Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydrideMillipore Sigma45291260 % dispersion in mineral oil
TetrahydrofuranFisher ScientificMTX02847Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC PlatesSorbtech1634067Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webinahttps://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract

References

  1. Ng, W. L., Bassler, B. L. Bacterial quorum-sensing network architectures. Annu Rev Genet. 43, 197-222 (2009).
  2. Barrasso, K., et al. Dual-function quorum-sensing systems in bacterial pathogens and symbionts. PLoS Pathog. 16, e1008934 (2020).
  3. Ball, A. S., Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Quorum sensing gene regulation by LuxR/HapR master regulators in Vibrios. J Bacteriol. 199 (19), 00105-00117 (2017).
  4. Ramos, J. L., et al. The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 326-356 (2005).
  5. Kim, B. S., et al. QStatin, a selective inhibitor of quorum sensing in Vibrio species. mBio. 9 (1), 02262 (2018).
  6. Kim, S. M., et al. LuxR homologue SmcR is essential for Vibrio vulnificus pathogenesis and biofilm detachment, and its expression is induced by host cells. Infect Immun. 81, 3721-3730 (2013).
  7. Hasegawa, H., Hase, C. C. TetR-type transcriptional regulator VtpR functions as a global regulator in Vibrio tubiashii. Appl Environ Microbiol. 75, 7602-7609 (2009).
  8. Dorn, S. K., Newman, J. D., Van Kessel, J. C., Brown, L. C. Synthesis and biological assay of small-molecule quorum sensing inhibitors: A three-week course-based undergraduate research experience. J Chem Educ. 98, 3533-3541 (2021).
  9. Newman, J. D., et al. Amino acid divergence in the ligand-binding pocket of Vibrio LuxR/HapR proteins determines the efficacy of thiophenesulfonamide inhibitors. Mol Microbiol. 116 (4), 1173-1188 (2021).
  10. Mohrig, J. R. H., Schatz, P. F. . Techniques in Organic Chemistry. 3. End. , (2001).
  11. Kochnev, Y., Hellemann, E., Cassidy, K. C., Durrant, J. D. Webina: An open-source library and web app that runs AutoDock Vina entirely in the web browser. Bioinformatics. 36, 4513-4515 (2020).
  12. Kim, Y., et al. Crystal structure of SmcR, a quorum-sensing master regulator of Vibrio vulnificus, provides insight into its regulation of transcription. J Biol Chem. 285, 14020-14030 (2010).
  13. . . The PyMOL molecular graphics system v. 2.0. , (2023).
  14. . PyMol wiki commands Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Category:Commands (2023)
  15. van Kessel, J. C., Ulrich, L. E., Zhulin, I. B., Bassler, B. L. Analysis of activator and repressor functions reveals the requirements for transcriptional control by LuxR, the master regulator of quorum sensing in Vibrio harveyi. mBio. 4 (4), 00378 (2013).
  16. Swenson, V. A., et al. Assessment and verification of commercially available pressure cookers for laboratory sterilization. PLoS One. 13, e0208769 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207 CURE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved