Sintesi e dosaggio di inibitori del quorum sensing del vibrione

Riepilogo

I composti tiofenesulfonammidici sono potenti e specifici inibitori dei regolatori del quorum sensing del vibrione LuxR/HapR che ne bloccano l'attività in vivo, impedendo così la trascrizione dei geni per la virulenza, la motilità e i biofilm. Questo protocollo descrive in dettaglio come questi composti vengono sintetizzati, modellati in silico e analizzati in vivo per l'attività contro LuxR/HapR.

Abstract

I batteri rilevano il numero di popolazioni locali utilizzando il quorum sensing, un metodo di comunicazione cellula-cellula ampiamente utilizzato per controllare i comportamenti batterici. Nelle specie Vibrio , i regolatori principali del quorum sensing LuxR/HapR controllano centinaia di geni quorum sensing, molti dei quali influenzano la virulenza, il metabolismo, la motilità e altro ancora. I tiofenesulfonammidi sono potenti inibitori di LuxR/HapR che legano la tasca del ligando in questi fattori di trascrizione e bloccano l'espressione genica del quorum sensing a valle. Questa classe di composti è servita come base per lo sviluppo di una serie di procedure semplici, robuste ed educative per gli studenti universitari per assimilare le loro competenze di chimica e biologia utilizzando un modello CURE: esperienza di ricerca universitaria basata su corsi. Vengono descritti protocolli ottimizzati che comprendono tre fasi di apprendimento in una piattaforma iterativa e multidisciplinare per coinvolgere gli studenti in una CURE della durata di un anno: (1) progettare e sintetizzare nuovi inibitori di piccole molecole basati sul nucleo di tiofenesulfonamide, (2) utilizzare la modellazione strutturale per prevedere l'affinità di legame con il bersaglio e (3) testare l'efficacia dei composti in saggi microbiologici contro specifiche proteine Vibrio LuxR/HapR. Il test reporter descritto eseguito in E. coli predice con successo l'efficacia dei composti contro le proteine bersaglio nelle specie native di Vibrio .

Introduzione

I batteri rilevano la densità della popolazione e il tipo di cellule vicine utilizzando un processo di comunicazione cellula-cellula chiamato quorum sensing (QS)¹. Diversi cladi di batteri utilizzano il QS per controllare vari comportamenti, come la motilità, la formazione di biofilm, la secrezione del fattore di virulenza e altro ancora. Le proteine e i segnali coinvolti nel QS differiscono ampiamente tra i batteri. Nelle specie Vibrio , il sistema di segnalazione QS utilizza prevalentemente recettori ibridi istidina-chinasi legati alla membrana che riconoscono specifici segnali di piccole molecole affini chiamati autoinduttori² (Figura 1). Questi recettori controllano il flusso di fosfato attraverso il sistema verso un regolatore di risposta che trascrive piccoli RNA. La produzione di sRNA altera la produzione del regolatore master quorum sensing, che è definito come un gruppo conservato di proteine chiamate collettivamente LuxR/HapR³. Così, a basse densità cellulari, l'mRNA che codifica LuxR/HapR viene degradato tramite il targeting dell'sRNA, e ad alta densità cellulare, la proteina LuxR/HapR viene prodotta ai massimi livelli (rivisto in Ball et ^al.3).

Il gruppo di proteine LuxR/HapR appartiene al grande gruppo delle proteine TetR, che è definito dalla presenza di un'elica-giro-elica nel dominio di legame del DNA, dalla formazione di un omodimero funzionale e tipicamente dall'inclusione di un dominio di legame del ligando⁴. Le proteine Vibrio LuxR/HapR soddisfano tutti questi criteri, anche se non è stato ancora identificato un ligando. La proteina LuxR/HapR in tutte le specie di Vibrioni studiate controlla numerosi comportamenti a valle, molti dei quali sono noti per essere importanti nella patogenesi: produzione di biofilm, proteasi, citotossine, emolisine, secrezione di tipo III e complessi di secrezione di tipo VI e altro ancora³. La delezione della proteina LuxR/HapR porta ad una diminuzione o perdita di virulenza nei sistemi ospiti ^5,6,7, portando all'ipotesi che l'inibizione di queste proteine sia una strategia praticabile per contrastare la progressione della malattia. Le specie di vibrioni causano la malattia da vibriosi negli organismi marini, inclusi pesci, crostacei e coralli, nonché negli esseri umani che entrano in contatto o ingeriscono determinate specie.

Ricerche precedenti hanno identificato un pannello di composti tiofenesulfonammidici che si legano specificamente al dominio di legame del ligando delle proteine LuxR/HapR in diverse specie di Vibrio per bloccarne la funzione ^5,8,9 (Figura 1). Utilizzando uno screening reporter in E. coli, i composti sono stati identificati e successivamente testati nel Vibrio nativo, che ha mostrato un'alta correlazione tra l'effetto nell'E. coli eterologo e l'efficacia nel Vibrio⁹. Questi composti sono semplici da sintetizzare in un unico passaggio, il che li rende ideali per la sintesi di piccole librerie nel contesto di un corso di laboratorio di biologia chimica. In precedenza è stata riportata un'esperienza di ricerca universitaria (CURE) di tre settimane basata su un corso che è stata progettata attorno a questa impalcatura molecolare⁸. Questo modulo di tre settimane è stato ulteriormente ottimizzato, semplificato e ampliato in questo CURE della durata di un anno, progettato per mirare all'inibizione delle proteine LuxR/HapR in diverse specie di Vibrio.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Progettazione e sintesi di librerie di tiofenesulfonamide

NOTA: Gli inibitori del tiofenesulfonamide come il 3-fenil-1-(tiofene-2-ilsulfonil)-1 H-pirazolo (PTSP) sono sintetizzati tramite la condensazione promossa dalla base in un solo passaggio ^8,9, come mostrato nella Figura 2. Per progettare nuove librerie di composti per lo studio, i ricercatori devono procurarsi ammine e cloruri di sulfonile appropriati e seguire i passaggi riassunti di seguito. Se la struttura dell'ammina differisce notevolmente dal derivato aromatico del pirazolo, potrebbe essere necessario identificare condizioni di reazione alternative mediante una ricerca in letteratura. Questa procedura è robusta e anche basi come idrossido di sodio, trietilammina e piridina hanno funzionato bene. Se questo viene eseguito in un corso, agli studenti può essere data la libertà di scegliere la propria procedura con probabili risultati favorevoli.

1. Sintesi e isolamento di PTSP
   NOTA: Questo può essere completato in un periodo di laboratorio di 3 ore.
   1. Sciogliere 822 mg di fenilpirazolo (5,7 mmol di ammina, 1,5 eq.) in 15 mL di tetraidrofurano in un pallone a fondo tondo da 50 mL con una barra di agitazione.
   2. Aggiungere lentamente 306 mg di idruro di sodio (60% in olio, 7,65 mmol, 2 eq.) per creare una sospensione. Lasciare mescolare questa sospensione su una piastra per mescolare per 10 minuti.
   3. In un flaconcino, preparare una soluzione di tiofenesulfonilcloruro (3,82 mmol di sulfonilcloruro, 1 eq.) in 5 mL di THF.
   4. Aggiungere la soluzione di cloruro di sulfonile preparata al punto 1.1.3 alla sospensione preparata al punto 1.1.2 e lasciare agitare la sospensione risultante per altri 30 minuti.
   5. Aggiungere 20 mL di acqua deionizzata alla miscela di reazione nel pallone a fondo tondo da 50 mL.
   6. Trasferire tutto il contenuto del pallone di reazione, ad eccezione dell'ancoretta di agitazione, in un imbuto separatore da 250 mL¹⁰.
   7. Aggiungere 20 mL di acetato di etile (EtOAc) all'imbuto separatore e agitare.
   8. Rimuovere lo strato inferiore (acquoso) e mettere da parte.
   9. Rimuovere lo strato superiore (organico) e metterlo da parte in un matraccio di Erlenmeyer da 200 ml.
   10. Rimettere lo strato acquoso nell'imbuto separatore ed estrarre con 20 mL di acetato di etile.
   11. Ripetere i passaggi 1.1.8 e 1.1.9.
   12. Rimettere gli strati organici combinati nell'imbuto separatore e lavare con 20 mL di NaCl saturo (salamoia).
   13. Rimuovere lo strato inferiore (acquoso) e mettere da parte.
   14. Scolare lo strato superiore (organico) nel pallone di Erlenmeyer.
   15. Asciugare gli strati organici combinati su MgSO₄ nel pallone di Erlenmeyer e filtrare in un pallone a fondo tondo da 250 mL utilizzando carta da filtro qualitativa¹⁰.
   16. Rimuovere il solvente organico su un evaporatore rotante.
2. Analizzare la miscela di reazione grezza mediante ¹H NMR per assicurarsi che il prodotto si sia formato¹⁰.
   NOTA: Il tempo necessario per questo passaggio dipenderà dal livello di comfort dello studente con la spettroscopia NMR.
3. Purificare il prodotto mediante cromatografia su colonna di gel di silice (esani 10:1: acetato di etile)¹⁰.
   NOTA: Questo può essere completato in un periodo di laboratorio di 3 ore.
4. Caratterizzare il prodotto spettroscopicamente.
   NOTA: Il tempo necessario per questo passaggio dipenderà dal livello di comfort dello studente con la spettroscopia NMR.
   NOTA: Dati di caratterizzazione per 3-fenil-1-(tiofene-2-ilsulfonil)-1-H-pirazolo (PTSP)¹⁰:
   ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).
   ¹³C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ): δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
   HRMS (ESI): Calcolato per C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]: 313.0076. Trovato: 313.0078.

2. Modellazione strutturale per prevedere il legame dei tiofenesulfonammidi al regolatore Vibrio LuxR/HapR

NOTA: Questo protocollo utilizza la versione web-based di AutoDock Vina chiamata Webina¹¹ per agganciare gli inibitori di piccole molecole (PTSP in questo caso) nella tasca di legame del ligando dell'omologo LuxR/HapR chiamato SmcR da Vibrio vulnificus¹². I risultati di questo protocollo sono (1) affinità di legame calcolate e (2) un file di struttura che può essere aperto in PyMol o in un programma correlato per visualizzare le interazioni ligando-proteina. Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi piccola molecola e qualsiasi proteina con una tasca di legame del ligando. Ci vogliono pochi minuti per attraccare a SmcR perché l'area di ricerca di questo recettore è definita di seguito. Se è necessario definire l'area di ricerca di un nuovo recettore (passaggi 2.15-2.20), questo può essere completato in un periodo di laboratorio di 3 ore. Una volta definita l'area di ricerca, gli attracchi successivi richiederanno minuti.

1. Scarica gli strumenti AutoDock. Selezionare il file appropriato per il sistema operativo e installarlo sul computer.
   NOTA: questo protocollo utilizza una versione basata sul Web di AutoDock Vina. L'aggancio può essere eseguito anche localmente se questo programma è installato (vedere le istruzioni del produttore).
2. Scarica la struttura per apo SmcR.
3. Passare alla banca dati delle proteine.
4. Nella barra di ricerca, inserisci l'ID PDB 3KZ9.
5. Fai clic su Scarica file dal menu a discesa verso l'angolo in alto a destra della pagina e seleziona il formato pdb .
6. Dopo aver scaricato il file, salvarlo in una nuova cartella dedicata al lavoro di aggancio.
7. Crea un file di struttura .mol dell'inibitore di piccole molecole (PTSP).
8. Passa a molview e fai clic sull'icona del cestino per rimuovere la struttura che si trova lì.
9. Disegna PTSP nella finestra della struttura.
10. Fare clic su 2D in 3D.
11. Fare clic su Strumenti → esportare → file MOL.
12. Un file intitolato "Molview.mol" verrà scaricato sul computer. Assegna al file un nome sensato e salvalo nella cartella che contiene il file pdb proteico.
13. Definire l'area di ricerca.
14. Definisci l'area in Webina come la tasca di legame della proteina (SmcR) per facilitare l'aggancio nella regione corretta.
    NOTA: Le coordinate per SmcR vengono fornite e generate utilizzando il seguente protocollo. Se si utilizza SmcR, i passaggi 2.15-2.20 possono essere saltati. Il protocollo può essere adattato per qualsiasi proteina con una tasca di legame del ligando nota. Coordinate: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. In AutoDock Tools, fare clic su File → Leggi molecola e aprire il file della proteina pdb scaricato nel passaggio 2.5.
16. Vai alla dashboard e fai clic sulla freccia blu accanto al nome della proteina. Verrà visualizzato un elenco di catene. Fare clic sulla freccia blu accanto a una delle catene proteiche.
17. Per evidenziare gli amminoacidi della tasca di legame, trova l'amminoacido di interesse nell'elenco che è apparso. Accanto all'amminoacido, vai al triangolo nella colonna Cl (colore) all'estrema destra. Fare clic sul triangolo e selezionare per arcobaleno.
    NOTA: Utilizzare questo metodo per evidenziare i seguenti amminoacidi: ¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (se manca Met100, questo può essere saltato).
18. Quindi, fai clic su Grid → GridBox. Dovrebbe apparire una casella sopra la struttura proteica con una faccia rossa, verde e blu. Prima di apportare qualsiasi modifica, modificare Spaziatura (angstrom) su 1. In questo modo si garantisce che la casella venga ridimensionata correttamente per i passaggi successivi.
    1. Quindi, cambia i quadranti della casella della griglia centrale per traslare la casella nelle direzioni x, y e z per posizionarla sopra gli amminoacidi evidenziati. Fare clic e trascinare sulla proteina per ruotare la struttura in tre dimensioni.
       NOTA: Questo aiuterà a garantire che la scatola sia nella posizione corretta. Se necessario, utilizzare i tre quadranti superiori per il numero di punti per modificare le dimensioni della casella.
19. Una volta impostate la posizione e le dimensioni della casella, fare clic su File → Chiudi Salvataggio corrente.
20. Nel menu, fare clic su Griglia → output → Salva GPF. Assegna un nome al file e salvalo nella stessa cartella dei due file di struttura. Questo file GPF ha le coordinate della casella.
21. Eseguire il "Docking" in Webina per generare un'energia di legame calcolata.
22. Aprire la cartella che contiene il file del ligando .mol e il file della proteina .pdb. Webina richiede i file .pdbqt e si occuperà della conversione dei file.
23. Vai a Webina.
24. Recettore: Trascina sul file scaricato dal pdb chiamato 3kz9.pdb. Fare clic su Aggiungi atomi di idrogeno e fare clic su Converti. Fare clic su Ok nel pop-up successivo per lavorare con un monomero.
25. Ligando: Trascina sul file .mol per PTSP (o altro inibitore di piccole molecole). Assicurati che non sia selezionata alcuna casella e fai clic su Converti. Lascia vuota la voce "Posa corretta" e scorri verso il basso fino alla Docking Box. Immettere i parametri della casella appropriati (quelli elencati sopra per SmcR o un set generato dal protocollo nei passaggi 2.15-2.20 per una proteina diversa).
26. Clicca su Avvia Webina e attendi.
27. Una serie di energie di legame calcolate sarà riportata [Affinità (kcal/mol)] direttamente sotto una visualizzazione della molecola agganciata. Assicurarsi che il primo valore sia il più negativo.
28. Per visualizzare il ligando agganciato in pymol o in un altro programma simile, scaricare il file PDBQT di output facendo clic sull'apposito pulsante di download . Questo file è solo il ligando (PTSP) nelle coordinate ancorate.
29. Visualizzare il complesso ligando-SmcR agganciato in PyMol¹³.
    1. Scarica e apri PyMol.
       NOTA: Gli studenti e gli educatori a tempo pieno possono ricevere gratuitamente una licenza PyMol. Quando viene richiesta una licenza dopo aver avviato PyMol per la prima volta, fare clic su Acquista licenza. Seleziona Studente/Insegnante.
    2. Apri il file pdb chiamato 3kz9.pdb.
    3. Apri il file di output pdbqt creato da Webina.
    4. Visualizza la migliore conformazione (quella con la più bassa affinità di legame) facendo clic sulle piccole frecce puntate in basso a destra della schermata di PyMol. La prima conformazione sarà la più favorevole e verrà visualizzata all'apertura del file.
    5. Manipolare la proteina con il ligando agganciato in PyMol utilizzando i comandi standard¹⁴.
       NOTA: Il precedente studio di Newman et al. ha confrontato le affinità di legame previste di diversi composti determinate da Webina con i saggi in vitro e in vivo ⁹. Queste affinità di legame servono come riferimenti per i composti che potrebbero essere buoni inibitori con affinità elevate (che sono correlate a numeri kcal/mol più bassi) per la tasca di legame. Un esempio dei dati di output di Webina è incluso nella Figura 3A, B per il legame PTSP nella tasca di SmcR.

3. Valutazione biologica dei tiofenesulfonammidici nell'inibizione del quorum sensing

NOTA: La procedura specifica per il dosaggio della proteina LuxR di Vibrio campbellii è descritta qui. Tuttavia, questa procedura può essere adattata per l'uso con qualsiasi proteina Vibrio LuxR/HapR, tutte disponibili su plasmidi a replicazione ectopica compatibili con il plasmide reporter pJV064⁹. Il test "red-green screen" viene eseguito in un background batterico eterologo utilizzando cellule di E. coli contenenti i due plasmidi. Il plasmide di espressione LuxR/HapR (che conferisce resistenza alla kanamicina) è disponibile esprimendo diversi geni LuxR (Figura 4A). Il plasmide pJV064 (che conferisce resistenza al cloramfenicolo) codifica per un gene gfp sotto il controllo di un promotore attivato da LuxR e per un gene mCherry sotto il controllo di un promotore represso da LuxR (Figura 4A). Entrambi i promotori sono stati scelti per la loro identificazione come geni regolati da LuxR con grandi cambiamenti nell'espressione in vivo¹⁵. I ceppi LuxR/HapR di E. coli e il plasmide pJV064 sono stati pubblicati in precedenza ^9,15.

1. Preparazione del terreno liquido: Preparare 1 L di LB medium.
   1. Pesare 10 g di NaCl, 10 g di bactotriptone e 5 g di estratto di lievito.
   2. Mescolare i componenti in un becher o in un cilindro graduato utilizzando una piastra di agitazione.
   3. Portare il volume totale a 1 L utilizzando cilindri graduati.
   4. Se lo si desidera, aliquotare in 100 ml per flacone prima della sterilizzazione in autoclave.
   5. Autoclavare per 15 minuti per ogni 1 L di fluido. In alternativa, se non è disponibile un'autoclave, è possibile utilizzare un Instant Pot¹⁶.
2. Inoculazione del ceppo (giorno 1)
   1. Aggiungere antibiotici al terreno LB alle concentrazioni finali di kanamicina (40 μg/mL) e cloramfenicolo (10 μg/mL).
   2. Aliquotare 5 mL di terreno LB/Kan40/CM10 in provette sterili con tappo.
   3. Inoculare ceppi di E. coli da stock congelati: coltura di E. coli che esprime LuxR/HapR e plasmide pJV064 (LuxR+)^9,15; Coltura di controllo a vettore vuoto di E. coli e plasmide pJV064 (LuxR-)^9,15.
   4. Agitare la coltura per una notte a 275 giri/min a 30 °C per 16-18 ore.
3. Dosaggio dei tiofenesulfonamici (Giorno 2)
   1. Pesare ~30 mg del composto. Risospendere a 100 mM in DMSO e vorticare per miscelare. Quindi, prepara un brodo da 10 mM.
   2. Miscelare 20 μl del materiale da 100 mM con 180 μl di DMSO per diluirlo (1:10) fino a ottenere un materiale di lavoro da 10 mM. Vortice per mescolare.
   3. Retrodiluire la coltura LuxR+ e le colture LuxR- (1:100) in 10 mL di terreno LB/Kan/CM in provette coniche da 15 mL e agitare brevemente per mescolare.
   4. Per il saggio, utilizzare una piastra sterile a 96 pozzetti a pozzetti neri, a fondo trasparente.
   5. Preparare una serie di diluizioni per tutte le colonne. Un diagramma della serie di diluizioni a 4 pieghe è incluso come riferimento (Figura 4B).
      NOTA: Per questo processo si consiglia una pipetta digitale multicanale. Questo metodo è per una serie di diluizioni a 4 volte (1:4). Tuttavia, possono essere utilizzate diverse serie di diluizione (ad esempio, 1:10, 1:5).
      1. Pipet 200 μL della miscela di coltura LuxR+ in una piastra a 96 pozzetti nella fila A, 1-6 (Figura 4B; verde).
      2. Pipet 200 μL della miscela di coltura LuxR- in una piastra a 96 pozzetti nella fila A, 7-12 (Figura 4B; arancione).
      3. Pipet 150 μl della miscela di coltura LuxR+ in una piastra a 96 pozzetti nelle file B-E, 1-6 (Figura 4B; verde).
      4. Pipet 150 μL della miscela di coltura LuxR- in una piastra a 96 pozzetti nelle file B-E, 7-12 (Figura 4B; arancione).
      5. Aggiungere 2 μl del composto o DMSO a ciascun pozzetto della fila A secondo la Figura 4B.
      6. Per ogni colonna, pipettare su e giù 3 volte, quindi trasferire 50 μl dalla riga A alla riga B, nella stessa colonna.
      7. Ripetere la miscelazione e il pipettaggio per le file B, C, D, E. Dopo aver mescolato la riga E, rimuovere 50 μl e gettare nei rifiuti. Alla fine, si dovrebbero avere 150 μL in ogni pozzetto.
   6. Coprire la piastra con nastro microporoso.
   7. Incubare la piastra agitando a 275 giri/min a 30 °C per una notte per 16-18 ore.
   8. Misurare la fluorescenza e la densità ottica delle piastre di analisi (Giorno 3).
      1. Rimuovere il nastro con cautela e non versare liquidi dai pozzetti.
      2. Su un lettore di piastre, leggere la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀), GFP e mCherry.
         NOTA: Si consiglia un guadagno impostato per entrambi i canali di fluorescenza per consentire il confronto tra i saggi.
   9. Registra i dati come fluorescenza normalizzata per cella: GFP/OD₆₀₀ e mCherry/OD₆₀₀.
   10. Tracciare i dati, come mostrato nella Figura 5, per illustrare i risultati del controllo DMSO rispetto ai campioni di prova.

4. Lavaggio delle piastre di analisi nere per il riutilizzo

1. Immergere i piatti nella candeggina.
   1. Etichettare un becher di plastica da 1 litro come "rifiuto biologico". Scaricare il liquido dai piatti in questo contenitore per rifiuti (pulire accuratamente eventuali gocce con il 70% di EtOH). Sciacquare le piastre con acqua deionizzata dalla bottiglia di spruzzatura sui rifiuti e versarla al suo interno.
   2. Etichettare un altro bicchiere di plastica da 1 litro come "30% candeggina". Mettere i piatti/coperchi in questo contenitore e coprire con il 30% di candeggina. Avvolgi la parte superiore con un foglio di plastica e pesa i piatti con una scatola per punte o qualcosa di simile. Lasciare riposare immersi nella soluzione di candeggina per una notte.
2. Sciacquare e immergere in etanolo.
   1. Sciacquare accuratamente le piastre con acqua deionizzata nel lavandino in modo che non rimanga candeggina. Scaricare l'acqua residua dai pozzi nel lavandino.
   2. Aggiungere il 70% di EtOH a tutti i pozzetti e coperchi utilizzando un flacone spray. Lascia che le piastre siano in posizione verticale con il coperchio in cima, ma di traverso in modo che l'EtOH possa evaporare, ma nulla cade nei pozzetti. Lascia riposare il piatto per una notte.
3. Lasciare asciugare i piatti.
   1. Svuota l'EtOH rimanente.
   2. Capovolgere il piatto su un tovagliolo di carta e lasciare evaporare il resto dell'EtOH. Lasciare le piastre in questo modo in una cappa aspirante. Le piastre saranno pronte per il prossimo utilizzo.

Risultati

Come risultati rappresentativi, sono inclusi i dati di tre composti di tiofenesulfonamide sintetizzati da studenti universitari per i composti 1A, 2B e 3B (Figura 5A-C; descritti in dettaglio in Newman et al.⁹). Ogni composto è stato testato nel ceppo di E. coli che esprime V. campbellii LuxR e utilizza il plasmide reporter pJV064. La fluorescenza normalizzata per cellula ?...

Discussione

Questo CURE è stato originariamente sviluppato come un protocollo abbreviato di due fasi e tre settimane (progettazione/sintesi e saggio) ed è stato implementato in cinque semestri come parte di un corso di laboratorio organico di livello superiore⁸. Dal rapporto originale, è stato aggiunto il modulo di modellazione al computer e il test di E. coli è stato ottimizzato per i ricercatori alle prime armi. Il protocollo risultante in tre fasi e due semest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract