Sintesi e dosaggio di inibitori del quorum sensing del vibrione

Riepilogo

I composti tiofenesulfonammidici sono potenti e specifici inibitori dei regolatori del quorum sensing del vibrione LuxR/HapR che ne bloccano l'attività in vivo, impedendo così la trascrizione dei geni per la virulenza, la motilità e i biofilm. Questo protocollo descrive in dettaglio come questi composti vengono sintetizzati, modellati in silico e analizzati in vivo per l'attività contro LuxR/HapR.

Abstract

I batteri rilevano il numero di popolazioni locali utilizzando il quorum sensing, un metodo di comunicazione cellula-cellula ampiamente utilizzato per controllare i comportamenti batterici. Nelle specie Vibrio , i regolatori principali del quorum sensing LuxR/HapR controllano centinaia di geni quorum sensing, molti dei quali influenzano la virulenza, il metabolismo, la motilità e altro ancora. I tiofenesulfonammidi sono potenti inibitori di LuxR/HapR che legano la tasca del ligando in questi fattori di trascrizione e bloccano l'espressione genica del quorum sensing a valle. Questa classe di composti è servita come base per lo sviluppo di una serie di procedure semplici, robuste ed educative per gli studenti universitari per assimilare le loro competenze di chimica e biologia utilizzando un modello CURE: esperienza di ricerca universitaria basata su corsi. Vengono descritti protocolli ottimizzati che comprendono tre fasi di apprendimento in una piattaforma iterativa e multidisciplinare per coinvolgere gli studenti in una CURE della durata di un anno: (1) progettare e sintetizzare nuovi inibitori di piccole molecole basati sul nucleo di tiofenesulfonamide, (2) utilizzare la modellazione strutturale per prevedere l'affinità di legame con il bersaglio e (3) testare l'efficacia dei composti in saggi microbiologici contro specifiche proteine Vibrio LuxR/HapR. Il test reporter descritto eseguito in E. coli predice con successo l'efficacia dei composti contro le proteine bersaglio nelle specie native di Vibrio .

Introduzione

I batteri rilevano la densità della popolazione e il tipo di cellule vicine utilizzando un processo di comunicazione cellula-cellula chiamato quorum sensing (QS)¹. Diversi cladi di batteri utilizzano il QS per controllare vari comportamenti, come la motilità, la formazione di biofilm, la secrezione del fattore di virulenza e altro ancora. Le proteine e i segnali coinvolti nel QS differiscono ampiamente tra i batteri. Nelle specie Vibrio , il sistema di segnalazione QS utilizza prevalentemente recettori ibridi istidina-chinasi legati alla membrana che riconoscono specifici segnali di piccole molecole af....

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Progettazione e sintesi di librerie di tiofenesulfonamide

NOTA: Gli inibitori del tiofenesulfonamide come il 3-fenil-1-(tiofene-2-ilsulfonil)-1 H-pirazolo (PTSP) sono sintetizzati tramite la condensazione promossa dalla base in un solo passaggio ^8,9, come mostrato nella Figura 2. Per progettare nuove librerie di composti per lo s....

Discussione

Questo CURE è stato originariamente sviluppato come un protocollo abbreviato di due fasi e tre settimane (progettazione/sintesi e saggio) ed è stato implementato in cinque semestri come parte di un corso di laboratorio organico di livello superiore⁸. Dal rapporto originale, è stato aggiunto il modulo di modellazione al computer e il test di E. coli è stato ottimizzato per i ricercatori alle prime armi. Il protocollo risultante in tre fasi e due semest.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract