ビブリオクォーラムセンシング阻害剤の合成とアッセイ

要約

チオフェネスルホンアミド化合物は、 ビブリオ クォーラムセンシングレギュレーターLuxR/HapRの強力で特異的な阻害剤であり、 in vivoでの活性を阻害し、病原性、運動性、およびバイオフィルムの遺伝子の転写を防ぎます。このプロトコールでは、これらの化合物がどのように合成され、 in silicoでモデル化され、in vivo でLuxR/HapRに対する活性がアッセイされるかについて詳しく説明します。

要約

細菌は、細菌の行動を制御するために広く利用されている細胞間コミュニケーションの方法であるクォーラムセンシングを使用して、局所的な集団数を検出します。 ビブリオ 種では、マスタークオラムセンシングレギュレーターであるLuxR/HapRが数百のクオラムセンシング遺伝子を制御しており、その多くは病原性、代謝、運動性などに影響を与えます。チオフェネスルホンアミドは、LuxR/HapRの強力な阻害剤であり、これらの転写因子のリガンドポケットに結合し、下流のクォーラムセンシング遺伝子発現を阻害します。このクラスの化合物は、大学生がCUREモデルを使用して化学と生物学のスキルを吸収するための、シンプルで堅牢で教育的な一連の手順の開発の基礎として機能しました。(1)チオフェネスルホンアミドコアに基づく新しい低分子阻害剤の設計と合成、(2)構造モデリングを使用してターゲットへの結合親和性を予測し、(3)特定の Vibrio LuxR/HapRタンパク質に対する微生物学的アッセイで化合物の有効性をアッセイする、反復的かつ学際的なプラットフォームでの3つの学習段階を含む最適化されたプロトコルが説明されています。 記載されている大腸菌 で実施されたレポーターアッセイは、天然 のビブリオ 種における標的タンパク質に対する化合物の有効性を首尾よく予測する。

概要

細菌は、クオラムセンシング(QS)¹と呼ばれる細胞間コミュニケーションプロセスを使用して、集団密度と近くの細胞の種類を感知します。細菌の多様なクレードは、QSを使用して、運動性、バイオフィルム形成、病原性因子分泌などのさまざまな行動を制御します。QSに関与するタンパク質とシグナルは、細菌によって大きく異なります。 ビブリオ 種では、QSシグナル伝達系は主に、自己誘導物質² と呼ばれる特定の同族の低分子シグナルを認識する膜結合ハイブリッドヒスチジン-キナーゼ受容体を使用します2(図1)。これらの受容体は、システム内を流れるリン酸塩から、低分子RNAを転写する応答調節因子への流れを制御します。sRNAの産生は、LuxR/HapR³と総称される保存されたタンパク質群として定義されるマスタークォーラムセンシングレギュレーターの産生を変化させます。したがって、低細胞密度では、LuxR/HapRをコードするmRNAはsRNAターゲティングによって分解され、高細胞密度では、LuxR/HapRタンパク質が最大レベルで産生されます(Ball et ^al.3でレビュー)。

プロトコル

本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. チオフェネスルホンアミドライブラリーの設計と合成

注:3-フェニル-1-(チオフェン-2-イルスルホニル)-1H-ピラゾール(PTSP)などのチオフェネスルホンアミド阻害剤は、図2に示すように、ワンステップ塩基促進縮合^8,9を介して合成されます。研究用の新しい化合物ライブラリーを設計するには、研究者は適切なアミンと塩化スルホニルを調達し、以下に要約する手順に従う必要があります。アミンの構造が芳香族ピラゾール誘導体と大きく異なる場合は、文献を検索して別の反応条件を特定する必要があるかもしれません。この手順は頑健であり、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジンなどの塩基もうまく機能しています。これがコースで行われる場合、学生は自分自身の手順を選択する自由を与えられる可能性があり、好ましい結果が得られる可能性があります。

1. PTSPの合成と単離
   注:これは、3時間のラボ期間1回で完....

ディスカッション

このCUREはもともと、2段階、3週間の短縮プロトコル(設計/合成およびアッセイ)として開発され、上位レベルの有機実験室コース⁸の一部として5学期に実施されました。最初のレポートから、コンピューターモデリングモジュールが追加され、 大腸菌 アッセイは初心者の研究者向けに最適化されました。その結果、インディアナ大学のArts and Sc.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract