Синтез и анализ ингибиторов чувствительности кворума вибриона

Резюме

Тиофенсульфонамидные соединения являются мощными и специфичными ингибиторами чувствительных к кворуму вибрионов регуляторов LuxR/HapR, которые блокируют их активность in vivo, тем самым предотвращая транскрипцию генов вирулентности, подвижности и биопленок. В этом протоколе подробно описано, как эти соединения синтезируются, моделируются in silico и анализируются in vivo на активность против LuxR/HapR.

Аннотация

Бактерии определяют численность местной популяции с помощью чувства кворума, метода межклеточной коммуникации, широко используемого для контроля поведения бактерий. У видов вибрионов регуляторы чувства главного кворума LuxR/HapR контролируют сотни генов, чувствительных к кворуму, многие из которых влияют на вирулентность, метаболизм, подвижность и многое другое. Тиофенсульфонамиды являются мощными ингибиторами LuxR/HapR, которые связываются с карманом лиганда в этих факторах транскрипции и блокируют экспрессию генов, чувствительных к кворуму. Этот класс соединений послужил основой для разработки набора простых, надежных и образовательных процедур для студентов колледжа, чтобы усвоить свои навыки в области химии и биологии с использованием модели CURE: исследовательского опыта бакалавриата на основе курса. Описаны оптимизированные протоколы, которые включают в себя три этапа обучения на итеративной и междисциплинарной платформе для вовлечения студентов в годичное CURE: (1) разработка и синтез новых низкомолекулярных ингибиторов на основе ядра тиофенсульфонамида, (2) использование структурного моделирования для прогнозирования аффинности связывания с мишенью и (3) анализ соединений на эффективность в микробиологических анализах против специфических белков Vibrio LuxR/HapR. Описанный репортерный анализ, проведенный для E. coli , успешно предсказывает эффективность соединений против целевых белков в нативных видах Vibrio .

Введение

Бактерии определяют плотность популяции и тип близлежащих клеток с помощью процесса межклеточной коммуникации, называемого чувством кворума (QS)¹. Различные клады бактерий используют QS для контроля различных форм поведения, таких как подвижность, образование биопленки, секреция фактора вирулентности и многое другое. Белки и сигналы, участвующие в QS, сильно различаются у разных бактерий. У видов Vibrio сигнальная система QS преимущественно использует мембраносвязанные гибридные рецепторы гистидинкиназы, которые распознают специфические родственные низкомолекулярные сигналы, называемые аутоиндукторами<....

протокол

Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованном для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Дизайн и синтез библиотек тиофенесульфонамида

Примечание: Ингибиторы тиофенсульфонамида, такие как 3-фенил-1-(тиофен-2-илсульфонил)-1 H-пиразол (PTSP), синтезируются путем одноступенчатой конденсации ^8,9, продвигаемой основаниями, как показано на рисунке 2. Чтобы разработать новые библиотеки соединений для исследования, исследов....

Результаты

В качестве репрезентативных результатов включены данные о трех тиофенсульфонамидных соединениях, синтезированных студентами бакалавриата для соединений 1A, 2B и 3B (рисунок 5A-C; подробно описано в Newman et al.⁹). Каждое сое?.......

Обсуждение

Этот CURE был первоначально разработан как сокращенный двухэтапный, трехнедельный протокол (дизайн/синтез и анализ) и был реализован в течение пяти семестров в рамках лабораторного курса верхнего уровня по органическому организму⁸. С момента составления п.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract