Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Тиофенсульфонамидные соединения являются мощными и специфичными ингибиторами чувствительных к кворуму вибрионов регуляторов LuxR/HapR, которые блокируют их активность in vivo, тем самым предотвращая транскрипцию генов вирулентности, подвижности и биопленок. В этом протоколе подробно описано, как эти соединения синтезируются, моделируются in silico и анализируются in vivo на активность против LuxR/HapR.

Аннотация

Бактерии определяют численность местной популяции с помощью чувства кворума, метода межклеточной коммуникации, широко используемого для контроля поведения бактерий. У видов вибрионов регуляторы чувства главного кворума LuxR/HapR контролируют сотни генов, чувствительных к кворуму, многие из которых влияют на вирулентность, метаболизм, подвижность и многое другое. Тиофенсульфонамиды являются мощными ингибиторами LuxR/HapR, которые связываются с карманом лиганда в этих факторах транскрипции и блокируют экспрессию генов, чувствительных к кворуму. Этот класс соединений послужил основой для разработки набора простых, надежных и образовательных процедур для студентов колледжа, чтобы усвоить свои навыки в области химии и биологии с использованием модели CURE: исследовательского опыта бакалавриата на основе курса. Описаны оптимизированные протоколы, которые включают в себя три этапа обучения на итеративной и междисциплинарной платформе для вовлечения студентов в годичное CURE: (1) разработка и синтез новых низкомолекулярных ингибиторов на основе ядра тиофенсульфонамида, (2) использование структурного моделирования для прогнозирования аффинности связывания с мишенью и (3) анализ соединений на эффективность в микробиологических анализах против специфических белков Vibrio LuxR/HapR. Описанный репортерный анализ, проведенный для E. coli , успешно предсказывает эффективность соединений против целевых белков в нативных видах Vibrio .

Введение

Бактерии определяют плотность популяции и тип близлежащих клеток с помощью процесса межклеточной коммуникации, называемого чувством кворума (QS)1. Различные клады бактерий используют QS для контроля различных форм поведения, таких как подвижность, образование биопленки, секреция фактора вирулентности и многое другое. Белки и сигналы, участвующие в QS, сильно различаются у разных бактерий. У видов Vibrio сигнальная система QS преимущественно использует мембраносвязанные гибридные рецепторы гистидинкиназы, которые распознают специфические родственные низкомолекулярные сигналы, называемые аутоиндукторами<....

протокол

Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованном для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Дизайн и синтез библиотек тиофенесульфонамида

Примечание: Ингибиторы тиофенсульфонамида, такие как 3-фенил-1-(тиофен-2-илсульфонил)-1 H-пиразол (PTSP), синтезируются путем одноступенчатой конденсации 8,9, продвигаемой основаниями, как показано на рисунке 2. Чтобы разработать новые библиотеки соединений для исследования, исследов....

Результаты

В качестве репрезентативных результатов включены данные о трех тиофенсульфонамидных соединениях, синтезированных студентами бакалавриата для соединений 1A, 2B и 3B (рисунок 5A-C; подробно описано в Newman et al.9). Каждое сое?.......

Обсуждение

Этот CURE был первоначально разработан как сокращенный двухэтапный, трехнедельный протокол (дизайн/синтез и анализ) и был реализован в течение пяти семестров в рамках лабораторного курса верхнего уровня по органическому организму8. С момента составления п.......

Раскрытие информации

JVK и LCB раскрывают финансовые интересы в Quornix, LLC, которые могут извлечь выгоду из результатов исследований тиофенсульфонамидных соединений.

Благодарности

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM124698 для JVK. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-thiophensulfonyl chlorideAmbeedA258464
3-Phenyl-1H-pyrazoleAmbeedA10440198%
96-well clear bottom black platesUSA Scientific5665-5090Q96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case 
Autodock Toolshttp://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vinahttps://vina.scripps.edu 
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetateFisher ScientificAA31344M4Reagent grade
hexanesFisher ScientificH291
Kanamycin
magnesium sulfateFisher ScientificM65-500Anhydrous
Microporous FilmUSA Scientific2920-1010Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molviewmolview.org
NaCl
Protein Databankhttps://www.rcsb.org/
Pymolhttps://pymol.org/2/
Qualitative filter paperFisher Scientific09-805-342Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gelSorbtech30930M-25Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydrideMillipore Sigma45291260 % dispersion in mineral oil
TetrahydrofuranFisher ScientificMTX02847Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC PlatesSorbtech1634067Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webinahttps://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract

Ссылки

  1. Ng, W. L., Bassler, B. L. Bacterial quorum-sensing network architectures. Annu Rev Genet. 43, 197-222 (2009).
  2. Barrasso, K., et al. Dual-function quorum-sensing systems in bacterial pathogens and symbionts.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

207CURE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены