Синтез и анализ ингибиторов чувствительности кворума вибриона

Резюме

Тиофенсульфонамидные соединения являются мощными и специфичными ингибиторами чувствительных к кворуму вибрионов регуляторов LuxR/HapR, которые блокируют их активность in vivo, тем самым предотвращая транскрипцию генов вирулентности, подвижности и биопленок. В этом протоколе подробно описано, как эти соединения синтезируются, моделируются in silico и анализируются in vivo на активность против LuxR/HapR.

Аннотация

Бактерии определяют численность местной популяции с помощью чувства кворума, метода межклеточной коммуникации, широко используемого для контроля поведения бактерий. У видов вибрионов регуляторы чувства главного кворума LuxR/HapR контролируют сотни генов, чувствительных к кворуму, многие из которых влияют на вирулентность, метаболизм, подвижность и многое другое. Тиофенсульфонамиды являются мощными ингибиторами LuxR/HapR, которые связываются с карманом лиганда в этих факторах транскрипции и блокируют экспрессию генов, чувствительных к кворуму. Этот класс соединений послужил основой для разработки набора простых, надежных и образовательных процедур для студентов колледжа, чтобы усвоить свои навыки в области химии и биологии с использованием модели CURE: исследовательского опыта бакалавриата на основе курса. Описаны оптимизированные протоколы, которые включают в себя три этапа обучения на итеративной и междисциплинарной платформе для вовлечения студентов в годичное CURE: (1) разработка и синтез новых низкомолекулярных ингибиторов на основе ядра тиофенсульфонамида, (2) использование структурного моделирования для прогнозирования аффинности связывания с мишенью и (3) анализ соединений на эффективность в микробиологических анализах против специфических белков Vibrio LuxR/HapR. Описанный репортерный анализ, проведенный для E. coli , успешно предсказывает эффективность соединений против целевых белков в нативных видах Vibrio .

Введение

Бактерии определяют плотность популяции и тип близлежащих клеток с помощью процесса межклеточной коммуникации, называемого чувством кворума (QS)¹. Различные клады бактерий используют QS для контроля различных форм поведения, таких как подвижность, образование биопленки, секреция фактора вирулентности и многое другое. Белки и сигналы, участвующие в QS, сильно различаются у разных бактерий. У видов Vibrio сигнальная система QS преимущественно использует мембраносвязанные гибридные рецепторы гистидинкиназы, которые распознают специфические родственные низкомолекулярные сигналы, называемые аутоиндукторами² (рис. 1). Эти рецепторы контролируют поток фосфатов через систему к регулятору ответа, который транскрибирует малые РНК. Производство мРНК изменяет выработку чувствительного регулятора главного кворума, который определяется как консервативная группа белков, объединенных под общим названием LuxR/HapR³. Таким образом, при низкой плотности клеток мРНК, кодирующая LuxR/HapR, разрушается за счет нацеливания на мРНК, а при высокой плотности клеток белок LuxR/HapR продуцируется на максимальных уровнях (рассмотрено в Ball et ^al.3).

Группа белков LuxR/HapR принадлежит к большой группе белков TetR, которая определяется наличием спирали-поворотной спирали в ДНК-связывающем домене, образованием функционального гомодимера и, как правило, включением лиганд-связывающего домена⁴. Белки Vibrio LuxR/HapR соответствуют всем этим критериям, хотя лиганд еще не идентифицирован. Белок LuxR/HapR у всех изученных видов вибрионов контролирует многочисленные последующие виды поведения, многие из которых, как известно, важны для патогенеза: производство биопленок, протеаз, цитотоксинов, гемолизинов, секреции III типа, секретных комплексов VI типа^{и т.} д. 3. Делеция белка LuxR/HapR приводит к снижению или потере вирулентности в системах хозяина ^5,6,7, что приводит к гипотезе о том, что ингибирование этих белков является жизнеспособной стратегией противодействия прогрессированию заболевания. Виды вибрионов вызывают болезнь вибриоза у морских организмов, включая рыб, моллюсков и кораллы, а также у людей, которые контактируют или проглатывают определенные виды.

В предыдущих исследованиях была выявлена панель тиофенсульфонамидных соединений, которые специфически связываются с лиганд-связывающим доменом белков LuxR/HapR в нескольких видах вибрионов для блокирования их функции ^5,8,9 (рис. 1). С помощью репортерного скрининга E. coli соединения были идентифицированы и впоследствии протестированы в нативном Vibrio, который показал высокую корреляцию между эффектом в гетерологичной E. coli и эффективностью в Vibrio⁹. Эти соединения легко синтезировать за один этап, что делает их идеальными для синтеза в небольших библиотеках в контексте лабораторного курса химической биологии. Ранее сообщалось о трехнедельном исследовательском опыте на основе курса бакалавриата (CURE), который был разработан на основе этого молекулярного каркаса⁸. Этот трехнедельный модуль был дополнительно оптимизирован, оптимизирован и расширен в этом годичном CURE, предназначенном для ингибирования белков LuxR/HapR у различных видов Vibrio.

протокол

Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованном для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Дизайн и синтез библиотек тиофенесульфонамида

Примечание: Ингибиторы тиофенсульфонамида, такие как 3-фенил-1-(тиофен-2-илсульфонил)-1 H-пиразол (PTSP), синтезируются путем одноступенчатой конденсации ^8,9, продвигаемой основаниями, как показано на рисунке 2. Чтобы разработать новые библиотеки соединений для исследования, исследователи должны приобрести соответствующие амины и сульфонилхлориды и выполнить шаги, кратко изложенные ниже. Если структура амина сильно отличается от ароматического производного пиразола, то может потребоваться определение альтернативных условий реакции путем поиска в литературе. Эта процедура надежна, и такие основания, как гидроксид натрия, триэтиламин и пиридин, также хорошо работают. Если это выполняется в рамках курса, студентам может быть предоставлена свобода выбора собственной процедуры с вероятными благоприятными результатами.

1. Синтез и выделение ПТСП
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать за один 3-часовой лабораторный период.
   1. Растворите 822 мг фенилпиразола (5,7 ммоль амина, 1,5 экв.) в 15 мл тетрагидрофурана в колбе с круглым дном объемом 50 мл с мешалкой.
   2. Медленно добавьте 306 мг гидрида натрия (60% в масле, 7,65 ммоль, 2 экв.) для создания суспензии. Дайте этой суспензии помешать на тарелке для перемешивания в течение 10 минут.
   3. Во флаконе приготовьте раствор тиофенсульфонилхлорида (3,82 ммоль сульфонилхлорида, 1 экв.) в 5 мл ТГФ.
   4. В приготовленную на шаге 1.1.2 суспензию добавить раствор сульфонилхлорида, приготовленный на шаге 1.1.3, и дать полученной суспензии помешать еще 30 мин.
   5. Добавьте 20 мл воды DI в реакционную смесь в колбе с круглым дном объемом 50 мл.
   6. Переложите все содержимое реакционной колбы, кроме перемешивающего стержня, в разделительную воронку объемом 250 мл¹⁰.
   7. Добавьте 20 мл этилацетата (EtOAc) в разделительную воронку и встряхните.
   8. Снимите нижний (водный) слой и отложите в сторону.
   9. Снимите верхний (органический) слой и отставьте в сторону в колбу Эрленмейера объемом 200 мл.
   10. Верните водный слой в разделительную воронку и извлеките 20 мл этилацетата.
   11. Повторите шаги 1.1.8 и 1.1.9.
   12. Скомбинированные органические слои вернуть в разделительную воронку и промыть 20 мл насыщенного NaCl (рассола).
   13. Снимите нижний (водный) слой и отложите в сторону.
   14. Слейте верхний (органический) слой обратно в колбу Эрленмейера.
   15. Высушите объединенные органические слои над MgSO₄ в колбе Эрленмейера и отфильтруйте в колбу с круглым дном объемом 250 мл с использованием качественной фильтровальной бумаги¹⁰.
   16. Удалите органический растворитель на ротационном испарителе.
2. Проанализируйте сырую реакционную смесь с помощью ¹ч ЯМР, чтобы убедиться, что продукт сформировался¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для этого этапа, будет зависеть от уровня комфорта студента при работе с ЯМР-спектроскопией.
3. Очистите продукт с помощью силикагелевой колоночной хроматографии (гексаны 10:1: этилацетат)¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать за один 3-часовой лабораторный период.
4. Характеризуйте продукт спектроскопически.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для этого этапа, будет зависеть от уровня комфорта студента при работе с ЯМР-спектроскопией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для определения характеристик 3-фенил-1-(тиофен-2-илсульфонил)-1 H-пиразола (ПТСП)¹⁰:
   ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl ₃): δ 8,11 (d, J = 2,8 Гц, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Гц, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Гц, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Гц, 1H).
   ¹³C ЯМР (101 МГц, CDCl ₃ ): δ 157,17, 136,84, 135,40, 135,36, 132,55, 131,28, 129,36, 128,72, 127,79, 126,47, 106,90.
   HRMS (ESI): Рассчитано для C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]: 313.0076. Найдено: 313.0078.

2. Структурное моделирование для прогнозирования связывания тиофенсульфонамидов с регулятором Vibrio LuxR/HapR

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует веб-версию AutoDock Vina под названием Webina¹¹ для док-инга низкомолекулярных ингибиторов (в данном случае PTSP) в карман связывания лиганда гомолога LuxR/HapR под названием SmcR из Vibrio vulnificus¹². Результатом работы этого протокола являются (1) расчетные аффинности связывания и (2) файл структуры, который может быть открыт в PyMol или связанной программе для визуализации лиганд-белковых взаимодействий. Этот протокол может быть адаптирован для любой малой молекулы и любого белка с карманом, связывающим лиганд. Стыковка с SmcR занимает несколько минут, потому что область поиска этого рецептора определена ниже. Если необходимо определить область поиска для нового рецептора (шаги 2.15-2.20), это может быть выполнено за один 3-часовой лабораторный период. После того, как область поиска определена, последующие стыковки займут несколько минут.

1. Загрузите инструменты AutoDock. Выберите подходящий файл для операционной системы и установите его на компьютер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует веб-версию AutoDock Vina. Стыковка также может быть выполнена локально, если установлена эта программа (см. инструкции производителя).
2. Скачать структуру для apo SmcR.
3. Перейдите в Банк данных о белках.
4. В строке поиска введите PDB ID 3KZ9.
5. Нажмите на кнопку «Загрузить файлы » в раскрывающемся меню в правом верхнем углу страницы и выберите формат pdb .
6. После скачивания файла сохраните его в новую папку, предназначенную для работы с доками.
7. Создайте файл структуры малых молекул (PTSP) в формате .mol.
8. Перейдите в molview и нажмите на значок мусорного ведра , чтобы удалить существующую там конструкцию.
9. Нарисуйте ПТСП в окне структуры.
10. Нажмите на 2D в 3D.
11. Нажмите « Инструменты» → экспортировать файл → MOL.
12. Файл с именем "Molview.mol" будет загружен на компьютер. Присвойте файлу имя, которое имеет смысл, и сохраните его в папке, содержащей файл protein pdb.
13. Определите область поиска.
14. Определите область в Webina как связывающий карман белка (SmcR), чтобы облегчить стыковку в нужной области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты для SmcR предоставляются и генерируются с использованием следующего протокола. Если используется SmcR, то шаги 2.15-2.20 можно пропустить. Протокол может быть адаптирован для любого белка с известным карманом, связывающим лиганд. Координаты: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. В AutoDock Tools нажмите « Файл» → «Прочитать молекулу » и откройте файл белка pdb, загруженный на шаге 2.5.
16. Перейдите на панель управления и нажмите на синюю стрелку рядом с названием белка. Это вызовет список цепочек. Нажмите на синюю стрелку рядом с одной из белковых цепочек.
17. Чтобы выделить аминокислоты связывающего кармана, найдите интересующую аминокислоту в появившемся списке. Рядом с аминокислотой перейдите к треугольнику в столбце Cl (цвет) справа. Нажмите на треугольник и выберите по радуге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для выделения следующих аминокислот:¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (если Met100 отсутствует, это можно пропустить).
18. Далее нажмите на Grid → GridBox. Над белковой структурой должна появиться коробка с красной, зеленой и синей гранью. Прежде чем вносить какие-либо изменения, измените Интервал (ангстрем) на 1. Это обеспечит правильное масштабирование коробки для следующих шагов.
    1. Затем измените диски Центральной сетки <смещение> чтобы переместить рамку в направлениях x, y и z, чтобы поместить ее поверх выделенных аминокислот. Нажмите и перетащите белок, чтобы повернуть структуру в трех измерениях.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это поможет убедиться, что коробка находится в правильном положении. При необходимости используйте три верхних циферблата по количеству точек, чтобы изменить размер коробки.
19. После того, как положение и размеры коробки установлены, нажмите « Файл» → «Закрыть» «Сохранить текущий».
20. В меню нажмите на Grid → Output → Save GPF. Присвойте файлу имя и сохраните его в той же папке, что и два файла структуры. Этот файл GPF содержит координаты коробки.
21. Выполните "Стыковку" в Webina для генерации рассчитанной энергии связывания.
22. Откройте папку, содержащую файл лиганда .mol и файл белка .pdb. Webina требует файлы .pdbqt и выполнит преобразование файлов.
23. Перейдите в Webina.
24. Рецептор: Перетащите файл, загруженный из pdb под названием 3kz9.pdb. Нажмите на Добавить атомы водорода и нажмите на Конвертировать. Нажмите на Ok в следующем всплывающем окне, чтобы работать с мономером.
25. Лиганд: Перетащите файл .mol для ПТСП (или другого низкомолекулярного ингибитора). Убедитесь, что флажки не выбраны, и нажмите «Конвертировать». Оставьте «Исправить позу» пустым и прокрутите вниз до док-бокса. Введите соответствующие параметры поля (либо перечисленные выше для SmcR, либо набор, который был сгенерирован протоколом на шагах 2.15-2.20 для другого белка).
26. Нажмите « Запустить Webina » и подождите.
27. Ряд рассчитанных энергий связи будет сообщен [Аффинность (ккал/моль)] непосредственно под визуализацией пристыкованной молекулы. Убедитесь, что первое значение является наиболее отрицательным.
28. Чтобы визуализировать пристыкованный лиганд в pymol или другой подобной программе, скачайте Output PDBQT File , нажав на соответствующую кнопку загрузки . Этот файл является просто лигандом (PTSP) в закрепленных координатах.
29. Визуализируйте пристыкованный комплекс лиганд-SmcR в PyMol¹³.
    1. Скачайте и откройте PyMol.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты и преподаватели очной формы обучения могут получить лицензию PyMol бесплатно. Когда вас попросят предоставить лицензию после первого запуска PyMol, нажмите «Купить лицензию». Выберите Ученик/Преподаватель.
    2. Откройте pdb-файл под названием 3kz9.pdb.
    3. Откройте выходной файл pdbqt, созданный Webina.
    4. Визуализируйте наилучшую конформацию (ту, у которой наименьшее сродство связывания), нажимая на маленькие указывающие стрелки в правом нижнем углу экрана PyMol. Первое подтверждение будет наиболее благоприятным и будет отображаться при открытии файла.
    5. Манипулируйте белком с помощью пристыкованного лиганда в PyMol с помощью стандартных команд¹⁴.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущем исследовании Newman et al. сравнивались предсказанные аффинности связывания нескольких соединений, определенных Webina, с анализами in vitro и in vivo ⁹. Эти аффинности связывания служат в качестве эталонов для соединений, которые, вероятно, являются хорошими ингибиторами с высоким сродством (которое коррелирует с более низкими числами ккал/моль) для связывающего кармана. Пример выходных данных Webina приведен на рисунках 3A, B для связывания PTSP в кармане SmcR.

3. Биологическая оценка тиофенсульфонамидов при ингибировании чувства кворума

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура определения белка Vibrio campbellii LuxR описана здесь. Тем не менее, эта процедура может быть адаптирована для использования с любым из белков Vibrio LuxR/HapR, все из которых доступны на эктопически реплицирующихся плазмидах, совместимых с репортерной плазмидой pJV064⁹. Анализ «красно-зеленого экрана» проводится на гетерологичном бактериальном фоне с использованием клеток E. coli, содержащих две плазмиды. Доступна экспрессия плазмиды LuxR/HapR (придающая устойчивость к канамицину) с экспрессией различных генов LuxR (рис. 4A). Плазмида pJV064 (придающая устойчивость к хлорамфениколу) кодирует ген gfp под контролем активируемого LuxR-промотора и ген mCherry под контролем LuxR-подавленного промотора (рис. 4A). Оба промотора были выбраны в связи с их идентификацией как LuxR-регулируемых генов с большими изменениями экспрессии in vivo¹⁵. Штаммы LuxR/HapR E. coli и плазмида pJV064 были опубликованы ранее ^9,15.

1. Приготовление жидкой среды: Приготовьте 1 л LB среды.
   1. Взвесьте 10 г NaCl, 10 г бактотриптона и 5 г дрожжевого экстракта.
   2. Смешайте компоненты в стакане или градуированном цилиндре с помощью мешалки.
   3. Доведите общий объем до 1 л с помощью градуированных цилиндров.
   4. При желании добавьте аликвоту в 100 мл на флакон перед автоклавированием.
   5. Автоклав в течение 15 мин на каждый 1 л среды. В качестве альтернативы, если автоклав недоступен, можно использовать Instant Pot¹⁶.
2. Инокуляция штамма (день 1)
   1. Добавляйте в среду ЛБ антибиотики в конечных концентрациях канамицина (40 мкг/мл) и хлорамфеникола (10 мкг/мл).
   2. Аликвоту 5 мл среды LB/Kan40/CM10 в стерильные пробирки с крышками.
   3. Инокулировать штаммы E. coli из морозильных запасов: культуру E. coli, экспрессирующую LuxR/HapR и плазмиду pJV064 (LuxR+)^9,15; Контрольная культура пустого вектора E. coli и плазмида pJV064 (LuxR-)^9,15.
   4. Встряхните культуру в течение ночи при 275 об/мин при 30 °C в течение 16-18 часов.
3. Анализ на тиофенсульфонамиды (День 2)
   1. Взвесьте ~30 мг соединения. Восстановите суспендию до 100 мМ в ДМСО и вихре для перемешивания. Далее приготовьте запас на 10 мМ.
   2. Смешайте 20 мкл 100 мМ материала со 180 мкл ДМСО, чтобы разбавить его (1:10) с получением 10 мМ рабочего состава. Вихрь перемешать.
   3. Разбавьте культуру LuxR+ и культуры LuxR-(1:100) в 10 мл среды LB/Kan/CM в конических пробирках объемом 15 мл и кратковременно перемешайте.
   4. Для анализа используйте стерильный 96-луночный планшет с черным дном.
   5. Подготовьте ряд разбавления для всех столбцов. Диаграмма ряда 4-кратного разбавления приведена в качестве исходного образца (рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого процесса рекомендуется использовать цифровую многоканальную дозатор. Этот метод предназначен для 4-кратного разведения (1:4). Однако могут использоваться различные ряды разведения (например, 1:10, 1:5).
      1. Пипетируйте 200 мкл культуры LuxR+ в 96-луночный планшет в ряду А, 1-6 (рис. 4B; зеленый).
      2. Пипетируйте 200 мкл культуры LuxR-, смешайте в 96-луночный планшет в ряду А, 7-12 (рис. 4В; оранжевый).
      3. Пипетируйте 150 мкл культуры LuxR+ в 96-луночный планшет в рядах B-E, 1-6 (рис. 4B; зеленый).
      4. Пипетируйте 150 мкл культуры LuxR-, смешайте в 96-луночный планшет в рядах B-E, 7-12 (рис. 4B; оранжевый).
      5. Добавьте 2 мкл соединения или ДМСО в каждую лунку ряда А в соответствии с рисунком 4В.
      6. Для каждой колонки пипетируйте вверх и вниз 3 раза, затем переведите 50 мкл из строки А в строку В, в ту же колонку.
      7. Повторите смешивание и пипетирование для рядов B, C, D, E. После смешивания ряда Е удалите 50 μл и положите в отходы. В конечном итоге, в каждой лунке должно быть по 150 μл.
   6. Накройте пластину микропористым скотчем.
   7. Инкубируйте планшет путем встряхивания при 275 об/мин при 30 °C в течение ночи в течение 16-18 часов.
   8. Измерьте флуоресценцию и оптическую плотность пробирных пластин (день 3).
      1. Снимите ленту аккуратно, и не выливайте жидкость из лунок.
      2. На считывателе пластин считайте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀), GFP и mCherry.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения между анализами рекомендуется установить коэффициент усиления для обоих флуоресцентных каналов.
   9. Записывайте данные в виде нормированной флуоресценции на клетку: GFP/OD₆₀₀ и mCherry/OD₆₀₀.
   10. Построите график данных, как показано на рисунке 5, чтобы проиллюстрировать результаты для контроля ДМСО в сравнении с тестовыми образцами.

4. Промывка черных пробирных пластин для повторного использования

1. Замочите пластины в хлорке.
   1. Пометьте пластиковый стакан объемом 1 л как «биологические отходы». Слейте жидкость с тарелок в этот контейнер для отходов (тщательно очистите все капли с 70% EtOH). Промойте пластины деионизионной водой из пульверизатора над отходами и слейте их в нее.
   2. Пометьте еще одну пластиковую мензурку объемом 1 л как «30% отбеливатель». Положите в эту емкость тарелки/крышки и залейте 30% отбеливателем. Оберните сверху полиэтиленовым листом и взвесьте тарелки коробкой для чаевых или чем-то подобным. Дайте погрузиться в раствор отбеливателя на ночь.
2. Промойте и замочите в этаноле.
   1. Тщательно промойте пластины деионизированной водой в раковину, чтобы не осталось отбеливателя. Слейте остатки воды из колодцев в раковину.
   2. Добавьте 70% EtOH во все лунки и крышки с помощью пульверизатора. Пусть пластины сидят вертикально, крышка сверху, но наклоненные, чтобы EtOH мог испариться, но ничего не попадало в лунки. Оставьте тарелку на ночь.
3. Дайте пластинам высохнуть.
   1. Сбросьте оставшийся EtOH.
   2. Переверните тарелку на бумажное полотенце и дайте оставшейся части этиона испариться. Оставьте пластины в таком виде в вытяжном шкафу. Пластины будут готовы к следующему использованию.

Результаты

В качестве репрезентативных результатов включены данные о трех тиофенсульфонамидных соединениях, синтезированных студентами бакалавриата для соединений 1A, 2B и 3B (рисунок 5A-C; подробно описано в Newman et al.⁹). Каждое сое?...

Обсуждение

Этот CURE был первоначально разработан как сокращенный двухэтапный, трехнедельный протокол (дизайн/синтез и анализ) и был реализован в течение пяти семестров в рамках лабораторного курса верхнего уровня по органическому организму⁸. С момента составления п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract