Vibrio Quorum Sensing Inhibitors의 합성 및 분석

요약

티오펜설폰아미드 화합물은 Vibrio quorum sensing regulator LuxR/HapR의 강력하고 특이적인 억제제로서 생체 내 활성을 차단하여 독성, 운동성 및 생물막에 대한 유전자의 전사를 방지합니다. 이 프로토콜은 이러한 화합물을 합성하고, 실리코로 모델링하고, LuxR/HapR에 대한 활성을 위해 생체 내에서 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

초록

박테리아는 박테리아의 행동을 제어하는 데 널리 사용되는 세포 간 통신 방법인 쿼럼 감지(quorum sensing)를 사용하여 지역 개체군 수를 감지합니다. 비브리오 종에서 마스터 쿼럼 감지 조절자인 LuxR/HapR은 수백 개의 쿼럼 감지 유전자를 제어하며, 그 중 다수는 독성, 신진대사, 운동성 등에 영향을 미칩니다. 티오펜설폰아미드는 이러한 전사 인자의 리간드 포켓에 결합하고 다운스트림 쿼럼 감지 유전자 발현을 차단하는 LuxR/HapR의 강력한 억제제입니다. 이 종류의 화합물은 대학생들이 CURE 모델(과정 기반 학부 연구 경험)을 사용하여 화학 및 생물학 기술을 동화할 수 있도록 하는 간단하고 강력하며 교육적인 절차 세트의 개발을 위한 기초 역할을 했습니다. 학생들이 1년 동안의 CURE에 참여할 수 있도록 반복적이고 다학제적인 플랫폼에서 세 가지 학습 단계로 구성된 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다: (1) 티오펜설폰아미드 코어를 기반으로 새로운 저분자 억제제를 설계 및 합성하고, (2) 구조 모델링을 사용하여 표적에 대한 결합 친화도를 예측하고, (3) 특정 Vibrio LuxR/HapR 단백질에 대한 미생물 분석에서 화합물을 분석합니다. E. coli 에서 수행된 기술된 리포터 분석은 네이티브 비브리오 종의 표적 단백질에 대한 화합물의 효능을 성공적으로 예측합니다.

서문

박테리아는 쿼럼 센싱(QS⁾¹이라고 하는 세포 간 통신 프로세스를 사용하여 개체군 밀도와 근처의 세포 유형을 감지합니다. 다양한 박테리아 군집은 QS를 사용하여 운동성, 생물막 형성, 독성 인자 분비 등과 같은 다양한 행동을 제어합니다. QS에 관여하는 단백질과 신호는 박테리아마다 크게 다릅니다. 비브리오 종에서 QS 신호 전달 시스템은 주로 자가유도자(autoinducer)라고 하는 특정 동족 소분자 신호를 인식하는 막 결합 하이브리드 히스티딘-키나아제 수용체(membrane-bound hybrid histidine-kinase receptor)를 사용합니다² (그림 1). 이 수용체는 시스템을 통해 작은 RNA를 전사하는 반응 조절자로 향하는 인산염의 흐름을 제어합니다. sRNA의 생산은 마스터 쿼럼 감지 조절자(master quorum sensing regulator)의 생산을 변화시키며, 이는 LuxR/HapR³이라고 통칭되는 보존된 단백질 그룹으로 정의됩니다. 따라서 낮은 세포 밀도에서 LuxR/HapR을 암호화하는 mRNA는 sRNA 표적화를 통해 분해되고 높은 세포 밀도에서는 LuxR/HapR 단백질이 최대 수준으로 생성됩니다(Ball et ^al.3에서 검토).

LuxR/HapR 단백질 그룹은 TetR 단백질의 큰 그룹에 속하며, 이는 DNA 결합 도메인에 나선-회전 나선의 존재, 기능적 호모다이머의 형성 및 일반적으로 리간드 결합 도메인⁴의 포함에 의해 정의됩니다. Vibrio LuxR/HapR 단백질은 리간드가 아직 확인되지 않았지만 이러한 모든 기준에 부합합니다. 연구된 모든 비브리오 종의 LuxR/HapR 단백질은 생물막, 프로테아제, 세포독소, 용혈, III형 분비, VI형 분비 복합체 등의 생산과 같이 발병에 중요한 것으로 알려진 수많은 다운스트림 행동을 조절합니다³. LuxR/HapR 단백질의 결실은 숙주 시스템 ^5,6,7에서 독성의 감소 또는 손실로 이어지며, 이는 이러한 단백질의 억제가 질병 진행을 막기 위한 실행 가능한 전략이라는 가설로 이어집니다. 비브리오 종은 어류, 조개류, 산호를 포함한 해양 생물뿐만 아니라 특정 종과 접촉하거나 섭취하는 인간에게도 비브리오증 질병을 일으킵니다.

이전 연구에서는 여러 Vibrio 종에서 LuxR/HapR 단백질의 리간드 결합 도메인에 특이적으로 결합하여 기능을 차단하는 티오펜설폰아미드 화합물 패널을 확인했습니다 ^5,8,9(그림 1). E. coli의 리포터 스크린을 사용하여 화합물을 식별하고 이후 천연 Vibrio에서 테스트한 결과, 이종 E. coli의 효과와 Vibrio⁹의 효능 사이에 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 화합물은 한 번에 간단하게 합성할 수 있어 화학 생물학 실험실 과정의 맥락에서 소규모 라이브러리 합성에 이상적입니다. 이 분자 골격을 중심으로 설계된 3주간의 과정 기반 학부 연구 경험(CURE)은 이전에^{보고된 바 있다 8}. 이 3주 모듈은 다양한 비브리오 종에서 LuxR/HapR 단백질의 억제를 목표로 설계된 이 1년 동안의 CURE에서 더욱 최적화, 간소화 및 확장되었습니다.

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. thiophenesulfonamide 라이브러리의 설계 및 합성

참고: 3-페닐-1-(티오펜-2-일설포닐)-1H-피라졸(PTSP)과 같은 티오펜설폰아미드 억제제는 그림 2와 같이 1단계 염기 촉진 축 합 ^8,9를 통해 합성됩니다. 연구를 위한 새로운 화합물 라이브러리를 설계하기 위해 연구자는 적절한 아민과 설포닐 클로라이드를 조달하고 아래에 요약된 단계를 따라야 합니다. 아민의 구조가 방향족 피라졸 유도체와 크게 다른 경우, 문헌을 검색하여 대체 반응 조건을 식별해야 할 수 있습니다. 이 절차는 강력하며 수산화나트륨, 트리에틸 아민 및 피리딘과 같은 염기도 잘 작동했습니다. 이것이 코스에서 수행되면 학생들은 유리한 결과를 얻을 수 있는 자신의 절차를 선택할 수 있는 자유가 주어질 수 있습니다.

1. PTSP의 합성 및 분리
   참고: 이 작업은 한 번의 3시간 랩 기간으로 완료할 수 있습니다.
   1. 교반 막대가 있는 50mL 둥근 바닥 플라스크에 테트라히드로푸란 15mL에 페닐피라졸 822mg(아민 5.7mmol, 1.5eq.)을 녹입니다.
   2. 수소화나트륨 306mg(오일 60%, 7.65mmol, 2당량)을 천천히 첨가하여 현탁액을 만듭니다. 이 현탁액을 교반 플레이트에서 10분 동안 저어줍니다.
   3. 바이알에 THF 5mL에 티오펜설포닐 클로라이드(3.82mmol의 설포닐 클로라이드, 1eq.) 용액을 준비합니다.
   4. 1.1.3 단계에서 준비한 설포닐 클로라이드 용액을 1.1.2 단계에서 준비된 현탁액에 첨가하고 결과 현탁액을 추가로 30분 동안 교반합니다.
   5. 50mL의 둥근 바닥 플라스크의 반응 혼합물에 20mL의 DI 물을 추가합니다.
   6. 교반 막대를 제외한 반응 플라스크의 모든 내용물을 250mL 분리 깔때기¹⁰에 옮깁니다.
   7. 분리 깔때기에 에틸 아세테이트(EtOAc) 20mL를 넣고 흔듭니다.
   8. 바닥(수성) 층을 제거하고 따로 보관하십시오.
   9. 상단(유기) 층을 제거하고 200mL 삼각 플라스크에 따로 보관합니다.
   10. 수성층을 분리 깔때기로 되돌리고 20mL의 에틸 아세테이트로 추출합니다.
   11. 1.1.8 및 1.1.9 단계를 반복합니다.
   12. 결합된 유기 층을 분리 깔때기로 되돌리고 20mL의 포화 NaCl(염수)로 세척합니다.
   13. 바닥(수성) 층을 제거하고 따로 보관하십시오.
   14. 상단(유기) 층을 Erlenmeyer 플라스크에 다시 배출합니다.
   15. 삼각 플라스크에서 MgSO₄ 위에 결합된 유기층을 건조시키고 정성적 여과지¹⁰을 사용하여 250mL의 둥근 바닥 플라스크에 여과합니다.
   16. 회전 증발기에서 유기 용매를 제거합니다.
2. 1H NMR로 조잡한 반응 혼합물을 분석하여 생성물이¹⁰을 형성했는지 확인합니다.
   알림: 이 단계에 필요한 시간은 NMR 분광법에 대한 학생의 편안함 수준에 따라 다릅니다.
3. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10:1 헥산: 에틸 아세테이트)로 제품을 정제합니다¹⁰.
   참고: 이 작업은 한 번의 3시간 랩 기간으로 완료할 수 있습니다.
4. 제품을 분광법으로 특성화합니다.
   알림: 이 단계에 필요한 시간은 NMR 분광법에 대한 학생의 편안함 수준에 따라 다릅니다.
   참고: 3-페닐-1-(티오펜-2-일설포닐)-1H-피라졸(PTSP)¹⁰에 대한 특성 분석 데이터:
   ¹ 개H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) : δ 8.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.88 - 7.79 (m, 3H), 7.68 (dd, J = 5.0, 1.4 Hz, 1H), 7.44 - 7.31 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 5.0, 3.9 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
   ¹³C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ): δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
   인적 자원 관리(ESI): C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M + Na ⁺]에 대해 계산 : 313.0076. 발견 : 313.0078.

2. Vibrio LuxR/HapR 조절자에 대한 티오펜설폰아미드의 결합을 예측하기 위한 구조 모델링

참고: 이 프로토콜은 Webina¹¹ 이라는 AutoDock Vina의 웹 기반 버전을 사용하여 소분자 억제제(이 경우 PTSP)를 Vibrio vulnificus¹²의 SmcR이라고 하는 LuxR/HapR 상동체의 리간드 결합 포켓에 도킹합니다. 이 프로토콜의 결과는 (1) 계산된 결합 친화도와 (2) 리간드-단백질 상호 작용을 시각화하기 위해 PyMol 또는 관련 프로그램에서 열 수 있는 구조 파일입니다. 이 프로토콜은 리간드 결합 포켓이 있는 모든 소분자 및 모든 단백질에 적용할 수 있습니다. 이 수용체에 대한 검색 영역이 아래에 정의되어 있기 때문에 SmcR에 도킹하는 데 몇 분이 걸립니다. 새로운 수용체에 대한 검색 영역을 정의해야 하는 경우(단계 2.15-2.20) 한 번의 3시간 랩 기간 내에 완료할 수 있습니다. 검색 영역이 정의되면 후속 도킹에 몇 분 정도 걸립니다.

1. AutoDock 도구를 다운로드합니다. 운영 체제에 적합한 파일을 선택하고 컴퓨터에 설치합니다.
   참고: 이 프로토콜은 AutoDock Vina의 웹 기반 버전을 사용합니다. 이 프로그램이 설치된 경우 도킹을 로컬로 수행할 수도 있습니다(제조업체의 지침 참조).
2. apo SmcR의 구조를 다운로드합니다.
3. 단백질 데이터 뱅크로 이동합니다.
4. 검색 창에 PDB ID 3KZ9를 입력합니다.
5. 페이지의 오른쪽 상단 모서리에 있는 드롭다운 메뉴에서 파일 다운로드 를 클릭하고 pdb 형식을 선택합니다.
6. 파일을 다운로드한 후 도킹 작업 전용의 새 폴더에 저장합니다 .
7. 소분자 억제제(PTSP)의 .mol 구조 파일을 만듭니다.
8. molview로 이동하여 휴지통 아이콘을 클릭하여 거기에 있는 구조를 제거합니다.
9. 구조 창에 PTSP를 그립니다.
10. 2D에서 3D로를 클릭합니다.
11. 도구를 클릭하여 MOL 파일로 내→→.
12. "Molview.mol"이라는 제목의 파일이 컴퓨터에 다운로드됩니다. 파일에 적절한 이름을 지정하고 protein pdb 파일이 들어 있는 폴더에 저장합니다 .
13. 검색 영역을 정의합니다.
14. Webina의 영역을 단백질의 결합 포켓(SmcR)으로 정의하여 올바른 영역에 쉽게 도킹할 수 있습니다.
    참고: SmcR에 대한 좌표는 다음 프로토콜을 사용하여 제공되고 생성됩니다. SmcR을 사용하는 경우 2.15-2.20단계를 건너뛸 수 있습니다. 이 프로토콜은 알려진 리간드 결합 포켓이 있는 모든 단백질에 적용할 수 있습니다. 좌표 : center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. AutoDock 도구에서 File → Read Molecule 을 클릭하고 2.5단계에서 다운로드한 pdb 단백질 파일을 엽니다.
16. 대시보드로 이동하여 단백질 이름 옆에 있는 파란색 화살표를 클릭합니다. 그러면 체인 목록이 나타납니다. 단백질 사슬 중 하나 옆에 있는 파란색 화살표를 클릭합니다.
17. 결합 포켓의 아미노산을 강조 표시하려면 나타나는 목록에서 관심 있는 아미노산을 찾으십시오. 아미노산 옆에 있는 맨 오른쪽의 Cl(색상) 열에 있는 삼각형으로 이동합니다. 삼각형을 클릭하고 무지개로 선택합니다.
    참고: 이 방법을 사용하여 ¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170(Met100이 없는 경우 건너뛸 수 있음)을 강조 표시합니다.
18. 그런 다음 그리드 → GridBox를 클릭합니다. 단백질 구조 위에 빨간색, 녹색 및 파란색 면이 있는 상자가 나타나야 합니다. 변경하기 전에 간격(옹스트롬) 을 1로 변경합니다. 이렇게 하면 다음 단계를 위해 상자의 크기가 올바르게 조정됩니다.
    1. 그런 다음 Center Grid Box 다이얼을 변경하여 상자를 x, y 및 z 방향으로 변환하여 강조 표시된 아미노산 위에 배치합니다. 단백질을 클릭하고 드래그하여 구조를 3차원으로 회전시킵니다.
       알림: 이렇게 하면 상자가 올바른 위치에 있는지 확인하는 데 도움이 됩니다. 필요한 경우 상단 3개의 다이얼을 포인트 수로 사용하여 상자의 크기를 변경합니다.
19. 상자 위치와 치수가 설정되면 File → Close Saving Current를 클릭합니다.
20. 메뉴에서 그리드 → 출력 → GPF 저장을 클릭합니다. 파일 이름을 지정하고 두 개의 구조 파일과 동일한 폴더에 저장합니다. 이 GPF 파일에는 상자 좌표가 있습니다.
21. Webina에서 "도킹"을 수행하여 계산된 결합 에너지를 생성합니다.
22. .mol ligand 파일과 .pdb 단백질 파일이 들어 있는 폴더를 엽니다. Webina에는 .pdbqt 파일이 필요하며 파일 변환을 수행합니다.
23. Webina로 이동합니다.
24. 수용체: pdb에서 다운로드한 3kz9.pdb라는 파일 위로 드래그합니다. Add hydrogen atoms(수소 원자 추가)를 클릭하고 convert(변환)를 클릭합니다. 다음 팝업에서 확인을 클릭하여 단량체로 작업합니다.
25. 리간드: PTSP(또는 기타 소분자 억제제)에 대한 .mol 파일 위로 드래그합니다. 상자가 선택되어 있지 않은지 확인하고 변환을 클릭하십시오. "Correct Pose"를 비워 두고 Docking Box까지 아래로 스크롤합니다. 적절한 상자 매개변수(SmcR에 대해 위에 나열된 것 또는 다른 단백질에 대한 2.15-2.20단계에서 프로토콜에 의해 생성된 세트)를 입력합니다.
26. Webina 시작을 클릭하고 기다립니다.
27. 일련의 계산된 결합 에너지는 도킹된 분자의 시각화 바로 아래에 [친화도(kcal/mol)]가 보고됩니다. 첫 번째 값이 가장 음수인지 확인합니다.
28. pymol 또는 다른 유사한 프로그램에서 도킹된 리간드를 시각화하려면 해당 다운로드 버튼을 클릭하여 출력 PDBQT 파일을 다운로드합니다. 이 파일은 도킹된 좌표의 리간드(PTSP)일 뿐입니다.
29. PyMol¹³에서 도킹된 ligand-SmcR 복합체를 시각화합니다.
    1. PyMol을 다운로드하여 엽니다.
       참고: 풀타임 학생 및 교육자는 PyMol 라이선스를 무료로 받을 수 있습니다. PyMol을 처음 시작한 후 라이선스를 요청하면 라이선스 구매를 클릭합니다. 학생/교사를 선택합니다.
    2. 3kz9.pdb라는 pdb 파일을 엽니다.
    3. Webina에서 만든 pdbqt 출력 파일을 엽니다.
    4. PyMol 화면의 오른쪽 하단에 있는 작은 가리키 는 화살표를 클릭하여 최상의 형태(결합 친화도가 가장 낮은 형태)를 시각화합니다. 첫 번째 형태가 가장 유리하며 파일을 열 때 표시됩니다.
    5. 표준 명령¹⁴를 사용하여 PyMol에서 도킹된 리간드로 단백질을 조작합니다.
       참고: Newman et al.의 이전 연구에서는 Webina에 의해 결정된 여러 화합물의 예측된 결합 친화도를 in vitro 및 in vivo assay와 비교했습니다⁹. 이러한 결합 친화도는 결합 포켓에 대한 높은 친화력(낮은 kcal/mol 수와 상관 관계가 있음)을 가진 우수한 억제제일 가능성이 있는 화합물에 대한 참조 역할을 합니다. Webina 출력 데이터의 예는 SmcR 포켓의 PTSP 바인딩에 대한 그림 3A,B에 포함되어 있습니다.

3. 쿼럼 감지 억제에서 티오펜설폰아미드의 생물학적 평가

참고: Vibrio campbellii 단백질 LuxR을 분석하기 위한 구체적인 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 그러나, 이 절차는 모든 Vibrio LuxR/HapR 단백질과 함께 사용하도록 조정할 수 있으며, 이들 모두는 리포터 플라스미드 pJV064⁹와 호환되는 ectopically 복제 플라스미드에서 사용할 수 있습니다. "red-green screen" 분석은 두 개의 플라스미드를 포함하는 E. coli 세포를 사용하여 이종 박테리아 배경에서 수행됩니다. 다양한 LuxR 유전자를 발현하는 LuxR/HapR 발현 플라스미드(카나마이신 저항성 부여)를 사용할 수 있습니다(그림 4A). pJV064 플라스미드(클로람페니콜 내성 부여)는 LuxR 활성화 프로모터의 제어 하에 있는 gfp 유전자와 LuxR 억제 프로모터의 제어 하에 있는 mCherry 유전자를 암호화합니다(그림 4A). 두 프로모터 모두 생체 내 발현에 큰 변화가 있는 LuxR-조절 유전자로 식별되었기 때문에 선택되었습니다 ¹⁵. LuxR/HapR E. coli 균주 및 플라스미드 pJV064는^{이전에 9,15}에 발표되었습니다.

1. 액체 매체 준비: LB 배지 1L를 준비합니다.
   1. NaCl 10g, 박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g의 무게를 잰다.
   2. 교반 플레이트를 사용하여 비커 또는 눈금이 매겨진 실린더의 구성 요소를 혼합합니다.
   3. 눈금 실린더를 사용하여 총 부피를 1L로 가져옵니다.
   4. 원하는 경우 고압멸균 전에 병당 100mL로 분주합니다.
   5. 매체 1L당 15분 동안 오토클레이브합니다. 또는 오토클레이브를 사용할 수 없는 경우 인스턴트팟을 사용할 수 있습니다¹⁶.
2. 균주 접종(1일차)
   1. 카나마이신(40μg/mL)과 클로람페니콜(10μg/mL)의 최종 농도에서 LB 배지에 항생제를 추가합니다.
   2. LB/Kan40/CM10 배지 5mL를 캡이 있는 멸균 시험관에 분취합니다.
   3. 냉동고 재고에서 대장균 균주 접종: LuxR/HapR 및 pJV064 플라스미드(LuxR+^)9,15를 발현하는 대장균 배양; E. coli 빈 벡터 대조군 배양 및 pJV064 플라스미드(LuxR-)^9,15.
   4. 275rpm, 30°C에서 16-18시간 동안 배양액을 밤새 흔듭니다.
3. 티오펜설폰아미드 분석(2일차)
   1. 화합물의 ~ 30 mg을 무게를 잰다. DMSO에서 100mM로 재현탁하고 와류하여 혼합합니다. 다음으로 10mM 스톡을 준비합니다.
   2. 100mM 스톡 20μL를 DMSO 180μL와 혼합하여 희석하여(1:10) 10mM 작업 스톡을 생성합니다. 소용돌이가 섞입니다.
   3. 10mL의 LB/Kan/CM 배지에 LuxR+ 배양액과 LuxR- 배양물(1:100)을 역희석하여 15mL 코니컬 튜브에 넣고 잠시 와류하여 혼합합니다.
   4. 분석을 위해 검은색 웰, 투명한 바닥, 멸균 96웰 플레이트를 사용합니다.
   5. 모든 컬럼에 대해 희석 시리즈를 준비합니다. 4-fold dilution series의 다이어그램이 참조로 포함되어 있습니다(그림 4B).
      알림: 이 과정에는 디지털 다중 채널 피펫이 권장됩니다. 이 방법은 4배 희석 시리즈(1:4)를 위한 것입니다. 그러나 다른 희석 시리즈가 사용될 수 있습니다(예: 1:10, 1:5).
      1. 200μL의 LuxR+ 배양 혼합물을 A, 1-6행의 96웰 플레이트에 피펫합니다(그림 4B, 녹색).
      2. 200μL의 LuxR- 배양 혼합물을 A, 7-12행의 96웰 플레이트에 피펫합니다(그림 4B, 주황색).
      3. 150μL의 LuxR+ 배양 혼합물을 B-E, 1-6행의 96웰 플레이트에 피펫합니다(그림 4B, 녹색).
      4. 150μL의 LuxR- 배양액을 B-E, 7-12행의 96웰 플레이트에 피펫 혼합물을 넣습니다(그림 4B, 주황색).
      5. 그림 4B에 따라 화합물 또는 DMSO의 2μL를 행 A의 각 웰에 추가합니다.
      6. 모든 컬럼에 대해 위아래로 3회 피펫한 다음 동일한 컬럼의 A행에서 B행으로 50μL를 전달합니다.
      7. B, C, D, E열에 대해 혼합 및 피펫팅을 반복합니다. E열을 혼합한 후 50μL를 제거하고 폐기물에 넣습니다. 결국 각 웰에 150μL가 있어야 합니다.
   6. 미세 다공성 테이프로 플레이트를 덮습니다.
   7. 30°C에서 275rpm으로 하룻밤 동안 16-18시간 동안 흔들어 플레이트를 배양합니다.
   8. assay plate의 형광 및 광학 밀도를 측정합니다(Day 3).
      1. 테이프를 조심스럽게 제거하고 우물에서 액체를 흘리지 마십시오.
      2. 플레이트 리더에서 600nm(OD₆₀₀), GFP 및 mCherry에서의 광학 밀도를 판독합니다.
         NOTE: 두 형광 채널에 대해 설정된 이득은 어세이 간의 비교를 가능하게 하기 위해 권장됩니다.
   9. 세포당 정규화된 형광으로 데이터 기록: GFP/OD₆₀₀ 및 mCherry/OD₆₀₀.
   10. 그림 5와 같이 데이터를 플로팅하여 테스트 샘플과 비교한 DMSO 대조군의 결과를 보여줍니다.

4. 재사용을 위한 검은색 분석 플레이트 세척

1. 접시를 표백제에 담그십시오.
   1. 1L 플라스틱 비커에 "생물학적 폐기물"이라는 라벨을 붙입니다. 접시의 액체를 이 폐기물 용기에 버리십시오(70% EtOH가 포함된 물방울을 조심스럽게 청소하십시오). 분출병의 DI 물로 접시를 헹구고 폐기물 위에 버리십시오.
   2. 다른 1L 플라스틱 비커에 "30% 표백제"라고 라벨을 붙입니다. 이 용기에 접시/뚜껑을 넣고 30% 표백제로 덮습니다. 플라스틱 시트로 상단을 감싸고 팁 상자 또는 이와 유사한 것으로 플레이트의 무게를 잰다. 표백제 용액에 밤새 담가두십시오.
2. 헹구고 에탄올에 담그십시오.
   1. 표백제가 남지 않도록 DI 물로 접시를 싱크대에 철저히 헹굽니다. 우물에 남아 있는 물을 싱크대로 버리십시오.
   2. 스프레이 병을 사용하여 모든 웰과 뚜껑에 70% EtOH를 첨가하십시오. 접시를 뚜껑이 위에 오도록 똑바로 세우되 EtOH가 증발할 수 있도록 비스듬히 놓지만 우물에 아무것도 떨어지지 않도록 합니다. 접시를 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
3. 접시를 말리십시오.
   1. 남아 있는 EtOH를 버리십시오.
   2. 접시를 종이 타월에 뒤집고 나머지 EtOH를 증발시킵니다. 플레이트를 흄 후드에 이런 식으로 두십시오. 플레이트는 다음 사용을 위해 준비됩니다.

결과

대표적인 결과로, 화합물 1A, 2B 및 3B에 대해 학부생이 합성한 3개의 티오펜설폰아미드 화합물의 데이터가 포함되어 있습니다(그림 5A-C; Newman et al.⁹). 각 화합물은 V. campbellii LuxR을 발현하고 pJV064 리포터 플라스미드를 사용하여 E. coli 균주에서 테스트했습니다. 각 분석에 대해 cell당 정규?...

토론

이 CURE는 원래 축약된 2단계, 3주 프로토콜(설계/합성 및 분석)로 개발되었으며 상위 수준의 유기 실험실 과정⁸의 일부로 5학기에 구현되었습니다. 최초 보고서 이후 컴퓨터 모델링 모듈이 추가되었고, E. coli assay는 초보 연구자를 위해 최적화되었습니다. 그 결과 3단계, 2학기 프로토콜은 1학년과 2학년 학생들이 수강하는 인디애나 대학교의 예술 및...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract