Vibrio Quorum Sensing Inhibitors의 합성 및 분석

요약

티오펜설폰아미드 화합물은 Vibrio quorum sensing regulator LuxR/HapR의 강력하고 특이적인 억제제로서 생체 내 활성을 차단하여 독성, 운동성 및 생물막에 대한 유전자의 전사를 방지합니다. 이 프로토콜은 이러한 화합물을 합성하고, 실리코로 모델링하고, LuxR/HapR에 대한 활성을 위해 생체 내에서 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

초록

박테리아는 박테리아의 행동을 제어하는 데 널리 사용되는 세포 간 통신 방법인 쿼럼 감지(quorum sensing)를 사용하여 지역 개체군 수를 감지합니다. 비브리오 종에서 마스터 쿼럼 감지 조절자인 LuxR/HapR은 수백 개의 쿼럼 감지 유전자를 제어하며, 그 중 다수는 독성, 신진대사, 운동성 등에 영향을 미칩니다. 티오펜설폰아미드는 이러한 전사 인자의 리간드 포켓에 결합하고 다운스트림 쿼럼 감지 유전자 발현을 차단하는 LuxR/HapR의 강력한 억제제입니다. 이 종류의 화합물은 대학생들이 CURE 모델(과정 기반 학부 연구 경험)을 사용하여 화학 및 생물학 기술을 동화할 수 있도록 하는 간단하고 강력하며 교육적인 절차 세트의 개발을 위한 기초 역할을 했습니다. 학생들이 1년 동안의 CURE에 참여할 수 있도록 반복적이고 다학제적인 플랫폼에서 세 가지 학습 단계로 구성된 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다: (1) 티오펜설폰아미드 코어를 기반으로 새로운 저분자 억제제를 설계 및 합성하고, (2) 구조 모델링을 사용하여 표적에 대한 결합 친화도를 예측하고, (3) 특정 Vibrio LuxR/HapR 단백질에 대한 미생물 분석에서 화합물을 분석합니다. E. coli 에서 수행된 기술된 리포터 분석은 네이티브 비브리오 종의 표적 단백질에 대한 화합물의 효능을 성공적으로 예측합니다.

서문

박테리아는 쿼럼 센싱(QS⁾¹이라고 하는 세포 간 통신 프로세스를 사용하여 개체군 밀도와 근처의 세포 유형을 감지합니다. 다양한 박테리아 군집은 QS를 사용하여 운동성, 생물막 형성, 독성 인자 분비 등과 같은 다양한 행동을 제어합니다. QS에 관여하는 단백질과 신호는 박테리아마다 크게 다릅니다. 비브리오 종에서 QS 신호 전달 시스템은 주로 자가유도자(autoinducer)라고 하는 특정 동족 소분자 신호를 인식하는 막 결합 하이브리드 히스티딘-키나아제 수용체(membrane-bound hybrid histidine-kinase receptor)를 사용합니다² (그림 1). 이 수용체는 시스템을 통해 작은 RNA를 전사하는 반응 조절자로 향하는 인산염의 흐름을 제어합니다. sRNA의 생산은 마스터 쿼럼 감지 조절자(master quorum sensing regulator)의 생산을 변화시키며, 이는 LuxR/HapR³이라고 통칭되는 보존된 단백질 그룹으로 정의됩니다. 따라서 낮은 세포 밀도에서 LuxR/HapR을 암호화하는 mRNA는 ....

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. thiophenesulfonamide 라이브러리의 설계 및 합성

참고: 3-페닐-1-(티오펜-2-일설포닐)-1H-피라졸(PTSP)과 같은 티오펜설폰아미드 억제제는 그림 2와 같이 1단계 염기 촉진 축 합 ^8,9를 통해 합성됩니다. 연구를 위한 새로운 화합물 라이브러리를 설계하기 위해 연구자는 적절한 아민과 설포닐 클로라이드를 조달하고 아래에 요약된 단계를 따라야 합니다. 아민의 구조가 방향족 피라졸 유도체와 크게 다른 경우, 문헌을 검색하여 대체 반응 조건을 식별해야 할 수 있습니다. 이 절차는 강력하며 수산화나트륨, 트리에틸 아민 및 피리딘과 같은 염기도 잘 작동했습니다. 이것이 코스에서 수행되면 학생들은 유리한 결과를 얻을 수 있는 자신의 절차를 선택할 수 있는 자유가 주어질 수 있습니다.

<....

토론

이 CURE는 원래 축약된 2단계, 3주 프로토콜(설계/합성 및 분석)로 개발되었으며 상위 수준의 유기 실험실 과정⁸의 일부로 5학기에 구현되었습니다. 최초 보고서 이후 컴퓨터 모델링 모듈이 추가되었고, E. coli assay는 초보 연구자를 위해 최적화되었습니다. 그 결과 3단계, 2학기 프로토콜은 1학년과 2학년 학생들이 수강하는 인디애나 대학교의 예술 및.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract