Synthèse et dosage d’inhibiteurs de détection du quorum de Vibrio

Résumé

Les composés thiophénésulfonamides sont des inhibiteurs puissants et spécifiques des régulateurs de détection du quorum Vibrio LuxR/HapR qui bloquent leur activité in vivo, empêchant ainsi la transcription des gènes de virulence, de motilité et de biofilms. Ce protocole détaille comment ces composés sont synthétisés, modélisés in silico et testés in vivo pour leur activité contre LuxR/HapR.

Résumé

Les bactéries détectent les nombres de population locale à l’aide de la détection de quorum, une méthode de communication entre cellules largement utilisée pour contrôler les comportements bactériens. Chez les espèces de Vibrio , les régulateurs de détection de quorum maîtres LuxR/HapR contrôlent des centaines de gènes de détection de quorum, dont beaucoup influencent la virulence, le métabolisme, la motilité, etc. Les thiophénésulfamides sont de puissants inhibiteurs de LuxR/HapR qui lient la poche de ligand dans ces facteurs de transcription et bloquent l’expression des gènes de détection du quorum en aval. Cette classe de composés a servi de base au développement d’un ensemble de procédures simples, robustes et éducatives permettant aux étudiants d’assimiler leurs compétences en chimie et en biologie à l’aide d’un modèle CURE : expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours. Des protocoles optimisés sont décrits qui comprennent trois étapes d’apprentissage dans une plateforme itérative et multidisciplinaire pour engager les étudiants dans une cure d’un an : (1) concevoir et synthétiser de nouveaux inhibiteurs de petites molécules basés sur le noyau de thiophènesulfonamide, (2) utiliser la modélisation structurelle pour prédire l’affinité de liaison à la cible, et (3) tester l’efficacité des composés dans des tests microbiologiques contre des protéines spécifiques de Vibrio LuxR/HapR. Le test rapporteur décrit effectué chez E. coli permet de prédire avec succès l’efficacité des composés contre les protéines cibles de l’espèce indigène Vibrio .

Introduction

Les bactéries détectent la densité de la population et le type de cellules à proximité à l’aide d’un processus de communication cellule-cellule appelé détection de quorum (QS)¹. Divers clades de bactéries utilisent le QS pour contrôler divers comportements, tels que la motilité, la formation de biofilms, la sécrétion de facteur de virulence, etc. Les protéines et les signaux impliqués dans le QS diffèrent considérablement d’une bactérie à l’autre. Chez les espèces de Vibrio , le système de signalisation QS utilise principalement des récepteurs hybrides histidine-kinase liés à la membrane qui reconnaiss....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conception et synthèse de banques de thiophènesulfonamides

REMARQUE : Les inhibiteurs du thiophènesulfonamide tels que le 3-phényl-1-(thiophène-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP) sont synthétisés par condensation de base en une étape ^8,9, comme le montre la figure 2. Pour concevoir de nouvelles bibliothèques de composés à étudier, l....

Discussion

Ce CURE a été développé à l’origine comme un protocole abrégé en deux étapes de trois semaines (conception/synthèse et essai) et a été mis en œuvre en cinq semestres dans le cadre d’un cours de laboratoire organique de niveau supérieur⁸. Depuis le rapport original, le module de modélisation informatique a été ajouté et le test E . coli a été optimisé pour les chercheurs novices. Le protocole en trois étapes et deux semestres qui e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract