弧菌群体感应抑制剂的合成和测定

摘要

噻吩磺酰胺化合物是弧 菌 群体感应调节因子 LuxR/HapR 的有效和特异性抑制剂，可阻断其 在体内的活性，从而阻止毒力、运动和生物膜基因的转录。该协议详细说明了这些化合物如何合成、 计算机建模以及 在体内 测定对 LuxR/HapR 的活性。

摘要

细菌使用群体感应来检测局部种群数量，群体感应是一种广泛用于控制细菌行为的细胞间通讯方法。在 弧菌 属中，主群体感应调节因子 LuxR/HapR 控制数百个群体感应基因，其中许多基因影响毒力、代谢、运动等。噻吩磺酰胺是 LuxR/HapR 的有效抑制剂，可结合这些转录因子中的配体口袋并阻断下游群体感应基因表达。这类化合物是开发一套简单、稳健和具有教育意义的程序的基础，让大学生使用 CURE 模型吸收他们的化学和生物学技能：基于课程的本科生研究经验。描述了优化的方案，这些方案包括迭代和多学科平台中的三个学习阶段，以吸引学生参与为期一年的 CURE：（1） 基于噻吩磺酰胺核心设计和合成新的小分子抑制剂，（2） 使用结构建模预测与靶标的结合亲和力，以及 （3） 测定化合物在微生物测定中对特定 弧菌 LuxR/HapR 蛋白的疗效。在 大肠杆菌 中进行的所述报告基因测定成功预测了化合物对天然 弧菌 物种中靶蛋白的功效。

引言

细菌使用称为群体感应 （QS）¹ 的细胞间通讯过程来感知群体密度和附近的细胞类型。不同的细菌分支使用 QS 来控制各种行为，例如运动、生物膜形成、毒力因子分泌等。QS 中涉及的蛋白质和信号因细菌而异。在 弧菌 属中，QS 信号转导系统主要使用膜结合的杂交组氨酸激酶受体，这些受体识别称为自诱导剂² 的特定同源小分子信号（图 1）。这些受体控制磷酸盐通过系统流向转录小 RNA 的反应调节因子。sRNA 的产生会改变主群体感应调节因子的产生，主群体感应调节因子被定义为一组保守的蛋白质，统称为 LuxR/HapR³。因此，在低细胞密度下，编码 LuxR/HapR 的 mRNA 通过 sRNA 靶向降解，而在高细胞密度下，LuxR/HapR 蛋白以最高水平产生（在 Ball 等人中综述³）。

LuxR/HapR 蛋白组属于 TetR 蛋白的大类，其定义是在 DNA 结合结构域中存在螺旋-转角-螺旋，形成功能性同型二聚体，并且通常包含配体结合结构域⁴。Vibrio LuxR/HapR 蛋白符合所有这些标准，但尚未确定配体。所有研究的弧菌物种中的 LuxR/HapR 蛋白控制着许多下游行为，其中许多已知在发病机制中很重要：生物膜、蛋白酶、细胞毒素、溶血素、III 型分泌和 VI 型分泌复合物等的产生³。LuxR/HapR 蛋白的缺失导致宿主系统中的毒力降低或丧失 ^5,6,7，从而得出抑制这些蛋白是对抗疾病进展的可行策略的假设。弧菌属会在海洋生物（包括鱼类、贝类和珊瑚）以及接触或摄入某些物种的人类中引起弧菌病。

先前的研究已经确定了一组噻吩磺酰胺化合物，这些化合物特异性结合多种弧菌属中 LuxR/HapR 蛋白的配体结合结构域，以阻断其功能 ^5,8,9（图 1）。使用大肠杆菌中的报告基因筛选，鉴定了化合物，随后在天然弧菌中进行了测试，结果显示异源大肠杆菌的效果与弧菌⁹ 中的功效之间存在高度相关性。这些化合物易于一步合成，非常适合在化学生物学实验课程中进行小文库合成。之前曾报道过围绕这种分子支架设计的为期三周的基于课程的本科生研究体验 （CURE）⁸。在这个为期一年的 CURE 中，这个为期三周的模块得到了进一步优化、简化和扩展，旨在抑制不同弧菌物种中的 LuxR/HapR 蛋白。

研究方案

用于研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 噻吩磺酰胺文库的设计与合成

注：硫代苯磺酰胺抑制剂，如 3-苯基-1-（噻吩-2-基磺酰基）-1H-吡唑 （PTSP） 是通过一步碱促进缩合 ^8,9 合成的，如图 2 所示。为了设计新的化合物库进行研究，研究人员必须获得合适的胺和磺酰氯，并遵循下面总结的步骤。如果胺的结构与芳香族吡唑衍生物有很大不同，则可能需要通过搜索文献来确定替代反应条件。该程序很稳健，氢氧化钠、三乙胺和吡啶等碱也效果很好。如果在课程中进行，学生可以自由选择自己的程序，并可能获得有利的结果。

1. PTSP 的合成和分离
   注意：这可以在一个 3 小时的实验期内完成。
   1. 将 822 mg 苯基吡唑（5.7 mmol 胺，1.5 当量）溶于 15 mL 四氢呋喃中，溶于带搅拌棒的 50 mL 圆底烧瓶中。
   2. 缓慢加入 306 mg 氢化钠（60% 油溶液，7.65 mmol，2 eq）以制备悬浮液。让这种悬浮液在搅拌板上搅拌 10 分钟。
   3. 在小瓶中，制备噻吩磺酰氯（3.82 mmol 磺酰氯，1 eq）在 5 mL THF 中的溶液。
   4. 将步骤 1.1.3 中制备的磺酰氯溶液添加到步骤 1.1.2 中制备的悬浮液中，并让所得悬浮液再搅拌 30 分钟。
   5. 向 50 mL 圆底培养瓶中的反应混合物中加入 20 mL 去离子水。
   6. 将反应瓶中除搅拌棒外的所有内容物转移到 250 mL 分离漏斗¹⁰ 中。
   7. 将 20 mL 乙酸乙酯 （EtOAc） 加入分离漏斗中并摇匀。
   8. 去除底层（水性）并放在一边。
   9. 去除顶层（有机）层，放在 200 mL 锥形瓶中。
   10. 将水层返回分离漏斗中，用 20 mL 乙酸乙酯提取。
   11. 重复步骤 1.1.8 和 1.1.9。
   12. 将合并的有机层放回分离漏斗中，用 20 mL 饱和 NaCl（盐水）洗涤。
   13. 去除底层（水性）并放在一边。
   14. 将顶层（有机）排回锥形瓶中。
   15. 在锥形瓶中干燥 MgSO₄ 上的合并有机层，并使用定性滤纸¹⁰ 过滤到 250 mL 圆底烧瓶中。
   16. 去除旋转蒸发仪上的有机溶剂。
2. 通过 ¹H NMR 分析粗反应混合物，以确保产物已形成¹⁰.
   注意：此步骤所需的时间将取决于学生对 NMR 波谱的熟悉程度。
3. 通过硅胶柱色谱法（10：1 己烷：乙酸乙酯）纯化产物¹⁰。
   注意：这可以在一个 3 小时的实验期内完成。
4. 用光谱法表征产物。
   注意：此步骤所需的时间将取决于学生对 NMR 波谱的熟悉程度。
   注：3-苯基-1-（噻吩-2-基磺酰基）-1H-吡唑 （PTSP） 的表征数据¹⁰：
   ¹H NMR （400 MHz， CDCl ₃ ）： δ 8.11 （d， J = 2.8 Hz， 1H）， 7.88 - 7.79 （m， 3H）， 7.68 （dd， J = 5.0， 1.4 Hz， 1H）， 7.44 - 7.31 （m， 3H）， 7.07 （dd， J = 5.0， 3.9 Hz， 1H）， 6.71 （d， J = 2.8 Hz， 1H）。
   ¹³C NMR（101 MHz，CDCl ₃）：δ 157.17、136.84、135.40、135.36、132.55、131.28、129.36、128.72、127.79、126.47、106.90。
   HRMS （ESI）： 计算 C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]：313.0076。找到：313.0078。

2. 预测噻吩磺酰胺与 Vibrio LuxR/HapR 调节剂结合的结构建模

注意：该方案利用称为 Webina¹¹ 的基于 Web 的 AutoDock Vina 版本将小分子抑制剂（在这种情况下为 PTSP）对接到来自 创伤弧菌¹² 的称为 SmcR 的 LuxR/HapR 同源物的配体结合口袋中。该协议的结果是 （1） 计算的结合亲和力和 （2） 可以在 PyMol 或相关程序中打开的结构文件，以可视化配体 - 蛋白质相互作用。该方案可适用于任何小分子和任何具有配体结合口袋的蛋白质。对接到 SmcR 需要几分钟，因为该受体的搜索区域定义如下。如果需要为新受体定义搜索区域（步骤 2.15-2.20），这可以在一个 3 小时的实验室期间完成。定义搜索区域后，后续停靠将需要几分钟。

1. 下载 AutoDock 工具。为操作系统选择适当的文件并将其安装在计算机上。
   注意：该协议使用基于 Web 的 AutoDock Vina 版本。如果安装了此程序，也可以在本地执行对接（请参阅制造商的说明）。
2. 下载 apo SmcR 的结构。
3. 导航到 Protein Database （蛋白质数据库）。
4. 在搜索栏中，输入 PDB ID 3KZ9。
5. 点击 下载文件 从页面右上角的下拉菜单中选择 pdb 格式。
6. 下载文件后，将其 保存到 专用于对接工作的新文件夹中。
7. 创建小分子抑制剂 （PTSP） 的 .mol 结构文件。
8. 导航到 molview 并单击 垃圾桶 图标以删除那里的结构。
9. 在结构窗口中绘制 PTSP。
10. 单击 2D 到 3D。
11. 单击 工具 →导出 MOL 文件→。
12. 标题为“Molview.mol”的文件将下载到计算机上。为文件指定一个有意义的名称，并将其 保存到 包含 protein pdb 文件的文件夹中。
13. 定义搜索区域。
14. 在 Webina 中将区域定义为蛋白质的结合口袋 （SmcR），以促进对接在正确的区域。
    注意： SmcR 的坐标使用以下协议提供和生成。如果正在使用 SmcR，则可以跳过步骤 2.15-2.20。该方案可适用于具有已知配体结合口袋的任何蛋白质。坐标：center_x = 17，center_y = 40，center_z = 56，size_x = 12，size_y = 12，size_z = 12。
15. 在 AutoDock 工具中，单击 File → Read Molecule ，然后打开在步骤 2.5 中下载的 pdb 蛋白质文件。
16. 导航到控制面板，然后单击蛋白质名称旁边的 蓝色箭头 。这将显示一个链列表。单击其中一个蛋白质链旁边的 蓝色箭头 。
17. 要突出显示结合口袋的氨基酸，请在出现的列表中找到感兴趣的氨基酸。在氨基酸旁边，转到最右侧的 Cl （颜色） 列中的三角形。单击三角形并 按 rainbow 选择。
    注：使用此方法突出显示以下氨基酸：¹² Phe75、Phe78、Leu79、Ile96、Met100、Trp114、Phe129、Asn133、Gln137、Val140、Ala163、Phe166、His167、Cys170（如果 Met100 缺失，可以跳过）。
18. 接下来，单击 Grid → GridBox。蛋白质结构上应出现一个带有红色、绿色和蓝色面的框。在进行任何更改之前，请将 Spacing （angstrom） （间距 （埃） ） 更改为 1。这将确保为后续步骤正确缩放框。
    1. 然后，更改 Center Grid Box（中心网格框<偏移> 刻度盘，在 x、y 和 z 方向上平移框，将其放置在突出显示的氨基酸上。单击并拖动蛋白质以在三个维度上旋转结构。
       注意： 这将有助于确保盒子处于正确的位置。如有必要，使用前三个刻度盘来表示点数，以更改框的大小。
19. 设置框位置和尺寸后，单击 File → Close Saving Current。
20. 在菜单中，单击 网格 → 输出 → 保存 GPF。为文件命名并将其保存在与两个结构文件相同的文件夹中。此 GPF 文件具有框坐标。
21. 在 Webina 中执行 “Docking” 以生成计算出的结合能。
22. 打开包含 .mol 配体文件和 .pdb 蛋白质文件的文件夹。Webina 需要 .pdbqt 文件，并将进行文件转换。
23. 导航到 Webina。
24. Receptor：拖到从 pdb 下载的名为 3kz9.pdb 的文件上。点击 添加氢原子，然后点击 转化率。单击下一个弹出窗口中的 Ok （确定 ） 以使用单体。
25. 配体：在 PTSP（或其他小分子抑制剂）的 .mol 文件上拖动。确保没有选中任何框，然后单击 转化率.将 “Correct Pose” 留空，然后向下滚动到 Docking Box。输入适当的框参数（上面列出的 SmcR 参数或方案在步骤 2.15-2.20 中为不同蛋白质生成的一组参数）。
26. 单击 启动 Webina 并等待。
27. 一系列计算的结合能将在停靠分子的可视化正下方报告 [亲和力 （kcal/mol）]。确保第一个值是最负的值。
28. 要在 pymol 或其他类似程序中可视化对接的配体，请单击相应的下载按钮下载输出 PDBQT 文件。这个文件只是停靠坐标中的配体 （PTSP）。
29. 在 PyMol¹³ 中可视化对接的配体-SmcR 复合物。
    1. 下载并打开 PyMol。
       注意：全日制学生和教育工作者可以免费获得 PyMol 许可证。首次启动 PyMol 后要求提供许可证时，单击 Buy License。选择 Student/Teacher （学生/教师）。
    2. 打开名为 3kz9.pdb 的 pdb 文件。
    3. 打开 Webina 创建的 pdbqt 输出文件。
    4. 通过单击 PyMol 屏幕右下角的指向 小箭头来 可视化最佳构象（具有最低结合亲和力的构象）。第一个构象将是最有利的，并将在打开文件时显示。
    5. 使用标准命令¹⁴ 在 PyMol 中用对接的配体操作蛋白质。
       注：Newman 等人之前的研究将 Webina 测定的几种化合物的预测结合亲和力与 体外 和 体内 测定进行了比较⁹。这些结合亲和力可作为化合物的参考，这些化合物可能是结合口袋具有高亲和力（与较低的 kcal/mol 值相关）的良好抑制剂。 图 3A、B 中包含 Webina 输出数据的示例，用于 SmcR 口袋中的 PTSP 绑定。

3. 噻吩磺酰胺类药物群体感应抑制的生物学评价

注：此处描述了专门用于检测坎氏弧菌蛋白 LuxR 的程序。然而，该程序可以适用于任何 Vibrio LuxR/HapR 蛋白，所有这些蛋白都可用于与报告质粒 pJV064⁹ 兼容的异位复制质粒。“红绿筛选”检测是在异源细菌背景下使用含有两种质粒的大肠杆菌细胞进行的。LuxR/HapR 表达质粒（赋予卡那霉素抗性）可用于表达不同的 LuxR 基因（图 4A）。pJV064 质粒 （赋予氯霉素抗性） 编码一个受 LuxR 激活启动子控制的 gfp 基因和一个受 LuxR 抑制启动子控制的 mCherry 基因（图 4A）。选择这两个启动子是因为它们被鉴定为 LuxR 调节的基因，在体内表达变化很大 ¹⁵。LuxR/HapR 大肠杆菌菌株和质粒 pJV064 之前已发表 ^9,15。

1. 液体培养基制备：制备 1 L LB 培养基。
   1. 称取 10 g NaCl、10 g 细菌胰蛋白胨和 5 g 酵母提取物。
   2. 使用搅拌板在烧杯或量筒中混合组分。
   3. 使用量筒将总体积降至 1 L。
   4. 如果需要，在高压灭菌前分装成每瓶 100 mL。
   5. 每 1 L 培养基高压灭菌 15 分钟。或者，如果没有高压灭菌器，可以使用 Instant Pot¹⁶。
2. 菌株接种（第 1 天）
   1. 向 LB 培养基中加入终浓度为卡那霉素 （40 μg/mL） 和氯霉素 （10 μg/mL） 的抗生素。
   2. 将 5 mL LB/Kan40/CM10 培养基分装到带盖的无菌试管中。
   3. 从冷冻库存中接种大肠杆菌菌株：表达 LuxR/HapR 和 pJV064 质粒 （LuxR+） 的大肠杆菌培养物^9,15;大肠杆菌空载体对照培养物和 pJV064 质粒 （LuxR-）^9,15。
   4. 将培养物在 30 °C 下以 275 rpm 摇动过夜 16-18 小时。
3. 噻吩磺酰胺的测定（第 2 天）
   1. 称取 ~30 mg 化合物。在 DMSO 中重悬至 100 mM 并涡旋混合。接下来，准备 10 mM 储备液。
   2. 将 20 μL 的 100 mM 储备液与 180 μL DMSO 混合以稀释 （1：10） 以得到 10 mM 的工作储备液。涡旋混合。
   3. 将 10 mL LB/Kan/CM 培养基中的 LuxR + 培养物和 LuxR- 培养物 （1：100） 反向稀释到 15 mL 锥形管中，并短暂涡旋混合。
   4. 使用黑孔、透明底、无菌 96 孔板进行检测。
   5. 为所有色谱柱准备稀释系列。包括 4 倍稀释系列的图表作为参考（图 4B）。
      注：此过程建议使用数字多通道移液器。该方法适用于 4 倍稀释系列 （1：4）。但是，可以使用不同的稀释系列（例如，1：10、1：5）。
      1. 将 200 μL 的 LuxR + 培养混合物移液到 A 行 1-6 的 96 孔板中（图 4B;绿色）。
      2. 将 200 μL 的 LuxR - 培养混合物移液到 A 行 7-12 的 96 孔板中（图 4B;橙色）。
      3. 将 150 μL 的 LuxR + 培养物混合物移液到 96 孔板中，排在 B-E、1-6 行中（图 4B;绿色）。
      4. 将 150 μL 的 LuxR - 培养物混合物移液到 96 孔板中，排在 B-E、7-12 行中（图 4B;橙色）。
      5. 根据 图 4B 向 A 行的每个孔中加入 2 μL 化合物或 DMSO。
      6. 对于每列，上下移液 3 次，然后将 50 μL 从 A 行转移到同一列的 B 行。
      7. 对 B、C、D、E 行重复混合和移液。混合 E 行后，取出 50 μL 并放入废液中。最后，每个孔中应有 150 μL。
   6. 用微孔胶带盖住板。
   7. 通过在 30 °C 下以 275 rpm 摇动过夜来孵育板 16-18 小时。
   8. 测量检测板的荧光和光密度（第 3 天）。
      1. 小心地取下胶带，不要将液体从孔中溢出。
      2. 在读板器上，读取 600 nm 处的光密度 （OD₆₀₀）、GFP 和 mCherry。
         注意：建议为两个荧光通道设置增益，以便能够在分析之间进行比较。
   9. 将数据记录为每个细胞的标准化荧光：GFP/OD₆₀₀ 和 mCherry/OD₆₀₀。
   10. 绘制数据图，如图 5 所示，以说明 DMSO 对照与测试样品的结果比较。

4. 清洗黑色检测板以重复使用

1. 将盘子浸泡在漂白剂中。
   1. 将 1 L 塑料烧杯标记为“生物废物”。将板中的液体倒入该废液容器中（用 70% 乙醇小心清理任何滴落物）。用喷瓶中的去离子水冲洗废液板，然后将其倒入其中。
   2. 将另一个 1 L 塑料烧杯标记为“30% 漂白剂”。将盘子/盖子放入此容器中，并用 30% 的漂白剂覆盖。用塑料片包裹顶部，并用小费盒或类似的东西称量板。让其浸没在漂白剂溶液中过夜。
2. 冲洗并浸泡在乙醇中。
   1. 用去离子水彻底冲洗板到水槽中，以免残留漂白剂。将井中剩余的水倒入水槽中。
   2. 使用喷雾瓶向所有孔和盖子中加入 70% 乙醇。让板直立放置，盖子在顶部但歪斜，以便 EtOH 可以蒸发，但没有任何东西落入孔中。让盘子静置一夜。
3. 让板子干燥。
   1. 倾倒任何剩余的 EtOH。
   2. 将板子翻转到纸巾上，让其余的 EtOH 蒸发。以这种方式将板放在通风橱中。这些板将准备好用于下次使用。

结果

作为代表性结果，包括来自本科生合成的化合物 1A、2B 和 3B 的三种噻吩磺酰胺化合物的数据（图 5A-C;在 Newman 等人中详细描述。⁹）. 在表达坎贝利弧菌 LuxR 的大肠杆菌菌株中，使用 pJV064 报告基因质粒对每种化合物进行了测试。显示了每个细胞的标准化荧光。使用1：10稀释系列进行测定...

讨论

该 CURE 最初是作为简化的两阶段、为期三周的方案（设计/合成和测定）开发的，并作为高级有机实验室课程的一部分在五个学期内实施⁸。自原始报告以来，增加了计算机建模模块，并针对新手研究人员优化了 大肠杆菌 检测。作为印第安纳大学艺术与科学本科生研究体验 （ASURE） 计划的一部分，由此产生的三阶段、两个学期的协议已经实施了 3 ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract