Síntese e Ensaio de Inibidores de Detecção de Quorum Vibrio

Resumo

Os compostos de tiofenesulfonamida são inibidores potentes e específicos dos reguladores de detecção de quorum Vibrio LuxR / HapR que bloqueiam sua atividade in vivo, impedindo assim a transcrição de genes para virulência, motilidade e biofilmes. Este protocolo detalha como esses compostos são sintetizados, modelados in silico e testados in vivo quanto à atividade contra LuxR / HapR.

Resumo

As bactérias detectam números da população local usando quorum sensing, um método de comunicação célula-célula amplamente utilizado para controlar comportamentos bacterianos. Nas espécies de Vibrio , os reguladores mestres de detecção de quorum LuxR / HapR controlam centenas de genes de detecção de quorum, muitos dos quais influenciam a virulência, metabolismo, motilidade e muito mais. As tiofenesulfonamidas são potentes inibidores de LuxR / HapR que se ligam à bolsa do ligante nesses fatores de transcrição e bloqueiam a expressão gênica de detecção de quorum a jusante. Essa classe de compostos serviu de base para o desenvolvimento de um conjunto de procedimentos simples, robustos e educacionais para estudantes universitários assimilarem suas habilidades de química e biologia usando um modelo CURE: experiência de pesquisa de graduação baseada em curso. São descritos protocolos otimizados que compreendem três estágios de aprendizado em uma plataforma iterativa e multidisciplinar para envolver os alunos em uma CURA de um ano: (1) projetar e sintetizar novos inibidores de moléculas pequenas com base no núcleo de tiofenessulfonamida, (2) usar modelagem estrutural para prever a afinidade de ligação ao alvo e (3) testar os compostos quanto à eficácia em ensaios microbiológicos contra proteínas específicas de Vibrio LuxR / HapR. O ensaio repórter descrito realizado em E. coli prevê com sucesso a eficácia dos compostos contra proteínas-alvo nas espécies nativas de Vibrio .

Introdução

As bactérias detectam a densidade populacional e o tipo de células próximas usando um processo de comunicação célula-célula chamado quorum sensing (QS)¹. Diversos clados de bactérias usam QS para controlar vários comportamentos, como motilidade, formação de biofilme, secreção de fator de virulência e muito mais. As proteínas e sinais envolvidos no QS diferem amplamente entre as bactérias. Nas espécies Vibrio , o sistema de sinalização QS usa predominantemente receptores híbridos de histidina-quinase ligados à membrana que reconhecem sinais específicos de pequenas moléculas cognatas chamadas autoindutores² (Figura 1). Esses receptores controlam o fluxo de fosfato através do sistema para um regulador de resposta que transcreve pequenos RNAs. A produção de sRNAs altera a produção do regulador de detecção de quorum mestre, que é definido como um grupo conservado de proteínas coletivamente chamado LuxR / HapR³. Assim, em baixas densidades celulares, o mRNA que codifica LuxR / HapR é degradado por meio do direcionamento de sRNA e, em alta densidade celular, a proteína LuxR / HapR é produzida em níveis máximos (revisado em Ball et ^al.3).

O grupo de proteínas LuxR / HapR pertence ao grande grupo de proteínas TetR, que é definido pela presença de uma hélice-volta-hélice no domínio de ligação ao DNA, formação de um homodímero funcional e, tipicamente, a inclusão de um domínio de ligação ao ligante⁴. As proteínas Vibrio LuxR / HapR se encaixam em todos esses critérios, embora um ligante ainda não tenha sido identificado. A proteína LuxR / HapR em todas as espécies de Vibrio estudadas controla vários comportamentos a jusante, muitos dos quais são conhecidos por serem importantes na patogênese: produção de biofilmes, proteases, citotoxinas, hemolisinas, secreção tipo III e complexos de secreção tipo VI e muito mais³. A deleção da proteína LuxR / HapR leva a uma diminuição ou perda de virulência nos sistemas hospedeiros ^5,6,7, levando à hipótese de que a inibição dessas proteínas é uma estratégia viável para neutralizar a progressão da doença. As espécies de Vibrio causam doenças de vibriose em organismos marinhos, incluindo peixes, moluscos e corais, bem como em humanos que entram em contato ou ingerem certas espécies.

Pesquisas anteriores identificaram um painel de compostos de tiofenesulfonamida que se ligam especificamente ao domínio de ligação ao ligante das proteínas LuxR / HapR em várias espécies de Vibrio para bloquear sua função ^5,8,9 (Figura 1). Usando uma tela repórter em E. coli, os compostos foram identificados e posteriormente testados no Vibrio nativo, que mostrou uma alta correlação entre o efeito na E. coli heteróloga e a eficácia no Vibrio⁹. Esses compostos são simples de sintetizar em uma única etapa, tornando-os ideais para síntese de pequenas bibliotecas no contexto de um curso de laboratório de biologia química. Uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de três semanas (CURE) que foi projetada em torno desse andaime molecular foi relatada anteriormente⁸. Este módulo de três semanas foi ainda mais otimizado, simplificado e ampliado neste CURE de um ano, projetado para atingir a inibição das proteínas LuxR / HapR em diversas espécies de Vibrio.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho e síntese de bibliotecas de tiofenessulfonamida

NOTA: Os inibidores de tiofenesulfonamida, como o 3-fenil-1-(tiofen-2-ilsulfonil)-1H-pirazol (PTSP), são sintetizados por meio da condensação promovida por base de uma etapa ^8,9, conforme mostrado na Figura 2. Para projetar novas bibliotecas de compostos para estudo, os pesquisadores devem adquirir aminas e cloretos de sulfonila apropriados e seguir as etapas resumidas abaixo. Se a estrutura da amina difere muito do derivado aromático do pirazol, então condições alternativas de reação podem precisar ser identificadas pesquisando a literatura. Este procedimento é robusto e bases como hidróxido de sódio, trietilamina e piridina também funcionaram bem. Se isso for realizado em um curso, os alunos podem ter a liberdade de escolher seu próprio procedimento com prováveis resultados favoráveis.

1. Síntese e isolamento de PTSP
   NOTA: Isso pode ser concluído em um período de laboratório de 3 horas.
   1. Dissolver 822 mg de fenilpirazol (5,7 mmol da amina, 1,5 eq.) em 15 ml de tetra-hidrofurano num balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação.
   2. Adicione lentamente 306 mg de hidreto de sódio (60% em óleo, 7,65 mmol, 2 eq.) para criar uma suspensão. Deixe esta suspensão mexer em uma placa de agitação por 10 min.
   3. Em um frasco, prepare uma solução de cloreto de tiofenossulfonilo (3,82 mmol de cloreto de sulfonilo, 1 eq.) em 5 mL de THF.
   4. Adicione a solução de cloreto de sulfonilo preparada na etapa 1.1.3 à suspensão preparada na etapa 1.1.2 e deixe a suspensão resultante agitar por mais 30 minutos.
   5. Adicionar 20 ml de água DI à mistura de reacção no balão redondo de fundo de 50 ml.
   6. Transferir todo o conteúdo do balão de reacção, com excepção da barra de agitação, para uma ampola de separação de 250 ml¹⁰.
   7. Adicionar 20 ml de acetato de etilo (EtOAc) à ampola de separação e agitar.
   8. Remova a camada inferior (aquosa) e reserve.
   9. Retirar a camada superior (orgânica) e retirar num erlenmeyer de 200 ml.
   10. Colocar a camada aquosa de volta na ampola de separação e extrair com 20 ml de acetato de etilo.
   11. Repita as etapas 1.1.8 e 1.1.9.
   12. Retorne as camadas orgânicas combinadas ao funil de separação e lave com 20 mL de NaCl saturado (salmoura).
   13. Remova a camada inferior (aquosa) e reserve.
   14. Drenar a camada superior (orgânica) de volta para o Erlenmeyer.
   15. Secar as camadas orgânicas combinadas sobre MgSO₄ no Erlenmeyer e filtrar para um balão de fundo redondo de 250 ml com papel de filtro^{qualitativo 10}.
   16. Remova o solvente orgânico em um evaporador rotativo.
2. Analise a mistura de reação bruta por ¹H NMR para garantir que o produto formou¹⁰.
   NOTA: O tempo necessário para esta etapa dependerá do nível de conforto do aluno com a espectroscopia de RMN.
3. Purificar o produto por cromatografia em coluna de sílica gel (hexanos 10:1: acetato de etilo)¹⁰.
   NOTA: Isso pode ser concluído em um período de laboratório de 3 horas.
4. Caracterize o produto espectroscopicamente.
   NOTA: O tempo necessário para esta etapa dependerá do nível de conforto do aluno com a espectroscopia de RMN.
   NOTA: Dados de caracterização para 3-fenil-1-(tiofen-2-ilsulfonil)-1H-pirazol (PTSP)¹⁰:
   ¹H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ): δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).
   ¹³C RMN (101 MHz, CDCl ₃ ): δ 157,17, 136,84, 135,40, 135,36, 132,55, 131,28, 129,36, 128,72, 127,79, 126,47, 106,90.
   HRMS (ESI): Calculado para C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]: 313.0076. Encontrado: 313.0078.

2. Modelagem estrutural para prever a ligação de tiofenesulfonamidas ao regulador Vibrio LuxR/HapR

NOTA: Este protocolo utiliza a versão baseada na web do AutoDock Vina chamada Webina¹¹ para acoplar inibidores de pequenas moléculas (PTSP neste caso) no bolso de ligação do ligante do homólogo LuxR / HapR chamado SmcR de Vibrio vulnificus¹². Os resultados deste protocolo são (1) afinidades de ligação calculadas e (2) um arquivo de estrutura que pode ser aberto no PyMol ou em um programa relacionado para visualizar as interações ligante-proteína. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer molécula pequena e qualquer proteína com uma bolsa de ligação ao ligante. Leva minutos para encaixar no SmcR porque a área de busca por esse receptor é definida abaixo. Se a área de pesquisa precisar ser definida para um novo receptor (etapas 2.15-2.20), isso pode ser concluído em um período de laboratório de 3 horas. Depois que a área de pesquisa for definida, os encaixes subsequentes levarão minutos.

1. Baixe as ferramentas do AutoDock. Selecione o arquivo apropriado para o sistema operacional e instale-o no computador.
   NOTA: Este protocolo utiliza uma versão baseada na web do AutoDock Vina. O encaixe também pode ser realizado localmente se este programa estiver instalado (consulte as instruções do fabricante).
2. Baixe a estrutura para apo SmcR.
3. Navegue até o Banco de Dados de Proteínas.
4. Na barra de pesquisa, insira o ID PDB 3KZ9.
5. Clique em Baixar arquivos no menu suspenso em direção ao canto superior direito da página e selecione o formato pdb .
6. Depois de baixar o arquivo, salve-o em uma nova pasta dedicada ao trabalho de encaixe.
7. Crie um arquivo de estrutura .mol do inibidor de moléculas pequenas (PTSP).
8. Navegue até molview e clique no ícone da lixeira para remover a estrutura que está lá.
9. Desenhe PTSP na janela de estrutura.
10. Clique em 2D para 3D.
11. Clique em Ferramentas → exportar → arquivo MOL.
12. Um arquivo intitulado "Molview.mol" será baixado para o computador. Dê ao arquivo um nome que faça sentido e salve-o na pasta que contém o arquivo protein pdb.
13. Defina a área de pesquisa.
14. Defina a área em Webina como a bolsa de ligação da proteína (SmcR) para facilitar o encaixe na região correta.
    NOTA: As coordenadas para SmcR são fornecidas e geradas usando o protocolo a seguir. Se o SmcR estiver sendo usado, as etapas 2.15 a 2.20 poderão ser ignoradas. O protocolo pode ser adaptado para qualquer proteína com uma bolsa de ligação de ligante conhecida. Coordenadas: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. No AutoDock Tools, clique em File → Read Molecule e abra o arquivo de proteína pdb baixado na etapa 2.5.
16. Navegue até o painel e clique na seta azul ao lado do nome da proteína. Isso abrirá uma lista de cadeias. Clique na seta azul ao lado de uma das cadeias de proteínas.
17. Para destacar os aminoácidos da bolsa de ligação, encontre o aminoácido de interesse na lista que apareceu. Ao lado do aminoácido, vá para o triângulo na coluna Cl (cor) na extrema direita. Clique no triângulo e selecione por arco-íris.
    NOTA: Use este método para destacar os seguintes aminoácidos: ¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (se Met100 estiver faltando, isso pode ser ignorado).
18. Em seguida, clique em Grid → GridBox. Uma caixa deve aparecer sobre a estrutura da proteína com uma face vermelha, verde e azul. Antes de fazer qualquer alteração, altere Espaçamento (angstrom) para 1. Isso garantirá que a caixa seja dimensionada corretamente para as próximas etapas.
    1. Em seguida, altere os mostradores da caixa de grade central para traduzir a caixa nas direções x, y e z para colocá-la sobre os aminoácidos destacados. Clique e arraste a proteína para girar a estrutura em três dimensões.
       NOTA: Isso ajudará a garantir que a caixa esteja na posição correta. Se necessário, use os três mostradores superiores para o número de pontos para alterar o tamanho da caixa.
19. Depois que a posição e as dimensões da caixa forem definidas, clique em Arquivo → Fechar Salvando Atual.
20. No menu, clique em Grid → Output → Save GPF. Nomeie o arquivo e salve-o na mesma pasta que os dois arquivos de estrutura. Este arquivo GPF tem as coordenadas da caixa.
21. Execute "Docking" em Webina para gerar uma energia de ligação calculada.
22. Abra a pasta que contém o arquivo de ligante .mol e o arquivo de proteína .pdb. O Webina requer arquivos .pdbqt e fará a conversão do arquivo.
23. Navegue até Webina.
24. Receptor: Arraste sobre o arquivo baixado do pdb chamado 3kz9.pdb. Clique em Adicionar átomos de hidrogênio e clique em converter. Clique em Ok no próximo pop-up para trabalhar com um monômero.
25. Ligante: arraste sobre o arquivo .mol para PTSP (ou outro inibidor de molécula pequena). Certifique-se de que nenhuma caixa esteja selecionada e clique em Converter. Deixe "Pose correta" vazio e role para baixo até a caixa de encaixe. Insira os parâmetros de caixa apropriados (aqueles listados acima para SmcR ou um conjunto que foi gerado pelo protocolo nas etapas 2.15-2.20 para uma proteína diferente).
26. Clique em Iniciar Webina e aguarde.
27. Uma série de energias de ligação calculadas será relatada [Afinidade (kcal / mol)] diretamente abaixo de uma visualização da molécula acoplada. Certifique-se de que o primeiro valor seja o mais negativo.
28. Para visualizar o ligante encaixado no pymol ou outro programa semelhante, baixe o arquivo PDBQT de saída clicando no botão de download apropriado. Esse arquivo é apenas o ligante (PTSP) nas coordenadas encaixadas.
29. Visualize o complexo ligante-SmcR encaixado no PyMol¹³.
    1. Baixe e abra o PyMol.
       NOTA: Estudantes e educadores em tempo integral podem receber uma licença PyMol gratuitamente. Quando for solicitada uma licença após iniciar o PyMol pela primeira vez, clique em Comprar licença. Selecione Aluno/Professor.
    2. Abra o arquivo pdb chamado 3kz9.pdb.
    3. Abra o arquivo de saída pdbqt criado pelo Webina.
    4. Visualize a melhor conformação (aquela com a menor afinidade de ligação) clicando nas pequenas setas apontando no canto inferior direito da tela do PyMol. A primeira conformação será a mais favorável e será exibida quando o arquivo for aberto.
    5. Manipule a proteína com o ligante encaixado em PyMol usando comandos padrão¹⁴.
       NOTA: O estudo anterior de Newman et al. comparou as afinidades de ligação previstas de vários compostos determinados por Webina com ensaios in vitro e in vivo ⁹. Essas afinidades de ligação servem como referências para compostos que provavelmente são bons inibidores com altas afinidades (que se correlacionam com números mais baixos de kcal / mol) para a bolsa de ligação. Um exemplo dos dados de saída do Webina está incluído na Figura 3A,B para ligação PTSP no bolso do SmcR.

3. Avaliação biológica de tiofenossulfonamidas na inibição de quorum sensing

NOTA: O procedimento específico para dosear a proteína LuxR do Vibrio campbellii é descrito aqui. No entanto, este procedimento pode ser adaptado para uso com qualquer uma das proteínas Vibrio LuxR / HapR, todas disponíveis em plasmídeos replicantes ectopicamente compatíveis com o plasmídeo repórter pJV064⁹. O ensaio de "tela vermelho-verde" é realizado em um fundo bacteriano heterólogo usando células de E. coli contendo os dois plasmídeos. O plasmídeo de expressão LuxR / HapR (conferindo resistência à canamicina) está disponível expressando diferentes genes LuxR ( Figura 4A ). O plasmídeo pJV064 (conferindo resistência ao cloranfenicol) codifica um gene gfp sob o controle de um promotor ativado por LuxR e um gene mCherry sob o controle de um promotor reprimido por LuxR (Figura 4A). Ambos os promotores foram escolhidos devido à sua identificação como genes regulados por LuxR com grandes alterações na expressão in vivo¹⁵. As cepas LuxR/HapR de E. coli e o plasmídeo pJV064 foram publicados anteriormente ^9,15.

1. Preparação de meios líquidos: Prepare 1 L de meio LB.
   1. Pese 10 g de NaCl, 10 g de bactotriptona e 5 g de extrato de levedura.
   2. Misture os componentes em um béquer ou cilindro graduado usando uma placa de agitação.
   3. Traga o volume total para 1 L usando cilindros graduados.
   4. Se desejar, alíquota em 100 mL por frasco antes de autoclavar.
   5. Autoclave por 15 min para cada 1 L de meio. Alternativamente, se uma autoclave não estiver disponível, um Instant Pot pode ser usado¹⁶.
2. Inoculação de cepas (Dia 1)
   1. Adicionar antibióticos ao meio LB nas concentrações finais de canamicina (40 μg/ml) e cloranfenicol (10 μg/ml).
   2. Alíquota de 5 mL de meio LB / Kan40 / CM10 em tubos de ensaio estéreis com tampas.
   3. Inocular estirpes de E. coli a partir de matérias-primas congelantes: cultura de E. coli que exprime LuxR/HapR e plasmídeo pJV064 (LuxR+)^9,15; Cultura de controle de vetor vazio de E. coli e plasmídeo pJV064 (LuxR-)^9,15.
   4. Agite a cultura durante a noite a 275 rpm a 30 °C por 16-18 h.
3. Ensaio de tiofenesulfonamidas (Dia 2)
   1. Pese ~ 30 mg do composto. Ressuspenda a 100 mM em DMSO e vórtice para misturar. Em seguida, prepare um estoque de 10 mM.
   2. Misture 20 μL do estoque de 100 mM com 180 μL de DMSO para diluí-lo (1:10) para obter um estoque de trabalho de 10 mM. Vórtice para misturar.
   3. Dilua novamente a cultura LuxR+ e as culturas LuxR- (1:100) em 10 mL de meio LB/Kan/CM em tubos cônicos de 15 mL e vórtice brevemente para misturar.
   4. Use uma placa de 96 poços estéreis de poço preto, de fundo transparente para o ensaio.
   5. Preparar uma série de diluições para todas as colunas. Um diagrama da série de diluição de 4 vezes é incluído como referência (Figura 4B).
      NOTA: Uma pipeta digital multicanal é recomendada para este processo. Este método é para uma série de diluições de 4 vezes (1:4). No entanto, podem ser utilizadas diferentes séries de diluição (por exemplo, 1:10, 1:5).
      1. Pipetar 200 μL da mistura de cultura LuxR+ em uma placa de 96 poços na linha A, 1-6 (Figura 4B; verde).
      2. Pipetar 200 μL da mistura de cultura LuxR em uma placa de 96 poços na linha A, 7-12 (Figura 4B; laranja).
      3. Pipetar 150 μL da mistura de cultura LuxR + em uma placa de 96 poços nas fileiras B-E, 1-6 (Figura 4B; verde).
      4. Pipetar 150 μL da mistura de cultura LuxR em uma placa de 96 poços nas fileiras B-E, 7-12 (Figura 4B; laranja).
      5. Adicione 2 μL do composto ou DMSO a cada poço da linha A de acordo com a Figura 4B.
      6. Para cada coluna, pipetar para cima e para baixo 3 vezes e, em seguida, transferir 50 μL da linha A para a linha B, na mesma coluna.
      7. Repita a mistura e pipetagem para as linhas B, C, D, E. Depois de misturar a linha E, remover 50 μL e colocar no lixo. No final, deve-se ter 150 μL em cada poço.
   6. Cubra a placa com fita microporosa.
   7. Incubar a placa agitando a 275 rpm a 30 °C durante a noite durante 16-18 h.
   8. Meça a fluorescência e a densidade óptica das placas de ensaio (Dia 3).
      1. Remova a fita com cuidado e não derrame líquido dos poços.
      2. Em um leitor de placas, leia a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀), GFP e mCherry.
         NOTA: Recomenda-se um ganho definido para ambos os canais de fluorescência para permitir comparações entre ensaios.
   9. Registre os dados como fluorescência normalizada por célula: GFP/OD₆₀₀ e mCherry/OD₆₀₀.
   10. Plote os dados, conforme mostrado na Figura 5, para ilustrar os resultados do controle DMSO em comparação com as amostras de teste.

4. Lavar as placas de ensaio pretas para reutilização

1. Mergulhe os pratos em água sanitária.
   1. Rotule um copo de plástico de 1 L como "lixo biológico". Despeje o líquido dos pratos neste recipiente de resíduos (limpe cuidadosamente quaisquer gotejamentos com 70% de EtOH). Enxágue as placas com água DI da garrafa de esguicho sobre os resíduos e despeje-os nela.
   2. Rotule outro copo de plástico de 1 L como "30% de alvejante". Coloque os pratos/tampas neste recipiente e cubra com 30% de água sanitária. Enrole a parte superior com uma folha de plástico e pese os pratos com uma caixa de pontas ou algo semelhante. Deixe descansar submerso na solução de alvejante durante a noite.
2. Enxágüe e mergulhe em etanol.
   1. Enxágue bem as placas com água DI na pia para que não fique alvejante. Despeje a água restante dos poços na pia.
   2. Adicione 70% de EtOH a todos os poços e tampas usando um borrifador. Deixe as placas ficarem eretas com a tampa em cima, mas tortas, para que o EtOH possa evaporar, mas nada caia nos poços. Deixe o prato descansar durante a noite.
3. Deixe as placas secarem.
   1. Despeje qualquer EtOH restante.
   2. Vire o prato sobre uma toalha de papel e deixe o resto do EtOH evaporar. Deixe as placas desta forma em um exaustor. As placas estarão prontas para o próximo uso.

Resultados

Como resultados representativos, são incluídos dados de três compostos de tiofenesulfonamida sintetizados por estudantes de graduação para os compostos 1A, 2B e 3B (Figura 5A-C; descrito em detalhes em Newman et al.⁹). Cada composto foi testado na cepa de E. coli expressando V. campbellii LuxR e usando o plasmídeo repórter pJV064. A fluorescência normalizada por cél...

Discussão

Este CURE foi originalmente desenvolvido como um protocolo abreviado de dois estágios e três semanas (projeto/síntese e ensaio) e foi implementado em cinco semestres como parte de um curso de laboratório orgânico de nível superior⁸. Desde o relatório original, o módulo de modelagem computacional foi adicionado e o ensaio de E. coli foi otimizado para pesquisadores iniciantes. O protocolo resultante de três estágios e dois semestres foi implement...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract