Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio

Resumen

Los compuestos de tiofenesulfonamida son inhibidores potentes y específicos de los reguladores de detección LuxR /HapR que bloquean su actividad in vivo, evitando así la transcripción de genes de virulencia, motilidad y biopelículas. Este protocolo detalla cómo se sintetizan, modelan in silico y analizan in vivo estos compuestos para determinar su actividad frente a LuxR/HapR.

Resumen

Las bacterias detectan el número de poblaciones locales mediante la detección de quórum, un método de comunicación célula a célula ampliamente utilizado para controlar los comportamientos bacterianos. En las especies de Vibrio , los reguladores maestros de detección de quórum LuxR/HapR controlan cientos de genes de detección de quórum, muchos de los cuales influyen en la virulencia, el metabolismo, la motilidad y más. Las tiofenesulfonamidas son potentes inhibidores de LuxR/HapR que se unen al bolsillo del ligando en estos factores de transcripción y bloquean la expresión génica de detección de quórum posterior. Esta clase de compuestos sirvió como base para el desarrollo de un conjunto de procedimientos simples, robustos y educativos para que los estudiantes universitarios asimilaran sus habilidades de química y biología utilizando un modelo CURE: experiencia de investigación de pregrado basada en cursos. Se describen protocolos optimizados que comprenden tres etapas de aprendizaje en una plataforma iterativa y multidisciplinaria para involucrar a los estudiantes en un CURE de un año de duración: (1) diseñar y sintetizar nuevos inhibidores de moléculas pequeñas basados en el núcleo de tiofenesulfonamida, (2) utilizar el modelado estructural para predecir la afinidad de unión al objetivo, y (3) analizar la eficacia de los compuestos en ensayos microbiológicos contra proteínas específicas de Vibrio LuxR/HapR. El ensayo reportero descrito realizado en E. coli predice con éxito la eficacia de los compuestos contra las proteínas objetivo en las especies nativas de Vibrio .

Introducción

Las bacterias detectan la densidad de población y el tipo de células cercanas mediante un proceso de comunicación célula a célula llamado detección de quórum (QS)¹. Diversos clados de bacterias utilizan QS para controlar diversos comportamientos, como la motilidad, la formación de biopelículas, la secreción de factores de virulencia, etc. Las proteínas y señales involucradas en el QS difieren ampliamente entre las bacterias. En las especies de Vibrio , el sistema de señalización QS utiliza predominantemente receptores híbridos de histidina-quinasa unidos a la membrana que reconocen señales específicas de moléculas pequeñas afines llamadas autoinductores² (Figura 1). Estos receptores controlan el flujo de fosfato a través del sistema a un regulador de respuesta que transcribe pequeños ARN. La producción de ARNs altera la producción del regulador de detección de quórum maestro, que se define como un grupo conservado de proteínas llamado colectivamente LuxR/HapR³. Así, a bajas densidades celulares, el ARNm que codifica LuxR/HapR se degrada a través de la diana del ARNs, y a alta densidad celular, la proteína LuxR/HapR se produce a niveles máximos (revisado en Ball et ^al.3).

El grupo de proteínas LuxR/HapR pertenece al gran grupo de proteínas TetR, que se define por la presencia de una hélice a su vez en el dominio de unión al ADN, la formación de un homodímero funcional y, por lo general, la inclusión de un dominio de unión al ligando⁴. Las proteínas Vibrio LuxR/HapR se ajustan a todos estos criterios, aunque aún no se ha identificado un ligando. La proteína LuxR/HapR en todas las especies de Vibrio estudiadas controla numerosos comportamientos posteriores, muchos de los cuales se sabe que son importantes en la patogénesis: producción de biopelículas, proteasas, citotoxinas, hemolisinas, complejos de secreción de tipo III y tipo VI, y más³. La deleción de la proteína LuxR/HapR conduce a una disminución o pérdida de virulencia en los sistemas huéspedes ^5,6,7, lo que lleva a la hipótesis de que la inhibición de estas proteínas es una estrategia viable para contrarrestar la progresión de la enfermedad. Las especies de Vibrio causan la enfermedad por vibriosis en organismos marinos, incluidos peces, mariscos y corales, así como en los seres humanos que entran en contacto o ingieren ciertas especies.

Investigaciones anteriores han identificado un panel de compuestos de tiofenesulfonamida que se unen específicamente al dominio de unión al ligando de las proteínas LuxR/HapR en múltiples especies de Vibrio para bloquear su función ^5,8,9 (Figura 1). Utilizando un cribado reportero en E. coli, se identificaron los compuestos y posteriormente se probaron en el Vibrio nativo, que mostró una alta correlación entre el efecto en la E. coli heteróloga y la eficacia en el Vibrio⁹. Estos compuestos son fáciles de sintetizar en un solo paso, lo que los hace ideales para la síntesis de bibliotecas pequeñas en el contexto de un curso de laboratorio de biología química. Una experiencia de investigación de pregrado (CURE) basada en un curso de tres semanas que se diseñó en torno a este andamiaje molecular ha sido reportada previamente⁸. Este módulo de tres semanas se ha optimizado, simplificado y ampliado aún más en este CURE de un año de duración diseñado para dirigirse a la inhibición de las proteínas LuxR / HapR en diversas especies de Vibrio.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño y síntesis de bibliotecas de tiofenesulfonamida

NOTA: Los inhibidores de la tiofenesulfonamida como el 3-fenil-1-(tiofen-2-ilsulfonil)-1 H-pirazol (PTSP) se sintetizan a través de la condensación promovida por la base en un solo paso ^8,9, como se muestra en la Figura 2. Para diseñar nuevas bibliotecas de compuestos para el estudio, los investigadores deben adquirir aminas y cloruros de sulfonilo apropiados y seguir los pasos que se resumen a continuación. Si la estructura de la amina difiere mucho del derivado aromático del pirazol, puede ser necesario identificar condiciones de reacción alternativas mediante la búsqueda en la literatura. Este procedimiento es robusto y bases como el hidróxido de sodio, la trietilamina y la piridina también han funcionado bien. Si esto se realiza en un curso, los estudiantes pueden tener la libertad de elegir su propio procedimiento con resultados probablemente favorables.

1. Síntesis y aislamiento del PTSP
   NOTA: Esto se puede completar en un período de laboratorio de 3 horas.
   1. Disolver 822 mg de fenilpirazol (5,7 mmol de la amina, 1,5 eq.) en 15 mL de tetrahidrofurano en un matraz de fondo redondo de 50 mL con una barra agitadora.
   2. Agregue lentamente 306 mg de hidruro de sodio (60% en aceite, 7,65 mmol, 2 eq.) para crear una suspensión. Deje que esta suspensión revuelva en una placa para remover durante 10 minutos.
   3. En un vial, prepare una solución de cloruro de tiofenesulfonilo (3,82 mmol de cloruro de sulfonilo, 1 eq.) en 5 mL de THF.
   4. Añadir la solución de cloruro de sulfonilo preparada en el paso 1.1.3 a la suspensión preparada en el paso 1.1.2 y dejar agitar la suspensión resultante durante 30 minutos más.
   5. Agregue 20 mL de agua desionizada a la mezcla de reacción en el matraz de fondo redondo de 50 mL.
   6. Transfiera todo el contenido del matraz de reacción, excepto la barra de agitación, a un embudo separador de 250 ml¹⁰.
   7. Añadir 20 mL de acetato de etilo (EtOAc) al embudo separador y agitar.
   8. Retirar la capa inferior (acuosa) y reservar.
   9. Retirar la capa superior (orgánica) y reservar en un matraz Erlenmeyer de 200 ml.
   10. Devolver la capa acuosa al embudo separador y extraer con 20 mL de acetato de etilo.
   11. Repita los pasos 1.1.8 y 1.1.9.
   12. Regrese las capas orgánicas combinadas al embudo separador y lave con 20 ml de NaCl saturado (salmuera).
   13. Retirar la capa inferior (acuosa) y reservar.
   14. Escurrir la capa superior (orgánica) de nuevo en el matraz Erlenmeyer.
   15. Seque las capas orgánicas combinadas sobre MgSO₄ en el matraz Erlenmeyer y filtre en un matraz de fondo redondo de 250 ml utilizando papel de filtro cualitativo¹⁰.
   16. Retire el solvente orgánico en un evaporador rotativo.
2. Analice la mezcla de reacción cruda por RMN ^{de 1}H para asegurarse de que el producto se haya formado¹⁰.
   NOTA: El tiempo necesario para este paso dependerá del nivel de comodidad del estudiante con la espectroscopia de RMN.
3. Purificar el producto mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexanos 10:1: acetato de etilo)¹⁰.
   NOTA: Esto se puede completar en un período de laboratorio de 3 horas.
4. Caracterizar el producto espectroscópicamente.
   NOTA: El tiempo necesario para este paso dependerá del nivel de comodidad del estudiante con la espectroscopia de RMN.
   NOTA: Datos de caracterización del 3-fenil-1-(tiofén-2-ilsulfonil)-1 H-pirazol (PTSP)¹⁰:
   ¹RMN H (400 MHz, CDCl ₃): δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).
   ^{RMN 13}C (101 MHz, CDCl ₃): δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
   Sistema de Gestión de Recursos Humanos (ESI): Calculado para C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]: 313,0076. Encontrado: 313.0078.

2. Modelado estructural para predecir la unión de tiofenesulfonamidas al regulador Vibrio LuxR/HapR

NOTA: Este protocolo utiliza la versión basada en la web de AutoDock Vina llamada Webina¹¹ para acoplar inhibidores de moléculas pequeñas (PTSP en este caso) en el bolsillo de unión de ligandos del homólogo de LuxR / HapR llamado SmcR de Vibrio vulnificus¹². Los resultados de este protocolo son (1) afinidades de unión calculadas y (2) un archivo de estructura que se puede abrir en PyMol o en un programa relacionado para visualizar las interacciones ligando-proteína. Este protocolo se puede adaptar a cualquier molécula pequeña y a cualquier proteína con un bolsillo de unión al ligando. Se tarda unos minutos en acoplarse a SmcR porque el área de búsqueda de este receptor se define a continuación. Si es necesario definir el área de búsqueda para un nuevo receptor (pasos 2.15-2.20), esto se puede completar en un período de laboratorio de 3 h. Una vez definida la zona de búsqueda, los acoplamientos posteriores tardarán unos minutos.

1. Descargue las herramientas de AutoDock. Seleccione el archivo apropiado para el sistema operativo e instálelo en la computadora.
   NOTA: Este protocolo utiliza una versión basada en la web de AutoDock Vina. El acoplamiento también se puede realizar localmente si este programa está instalado (consulte las instrucciones del fabricante).
2. Descargue la estructura de apo SmcR.
3. Navegue hasta el banco de datos de proteínas.
4. En la barra de búsqueda, introduzca el ID de PDB 3KZ9.
5. Haga clic en Descargar archivos en el menú desplegable hacia la esquina superior derecha de la página y seleccione el formato pdb .
6. Después de descargar el archivo, guárdelo en una nueva carpeta dedicada al trabajo de acoplamiento.
7. Cree un archivo de estructura .mol del inhibidor de molécula pequeña (PTSP).
8. Navega hasta molview y haz clic en el icono de la papelera para eliminar la estructura que hay allí.
9. Dibuje PTSP en la ventana de estructura.
10. Haga clic en 2D a 3D.
11. Haga clic en Herramientas → exportar → archivo MOL.
12. Se descargará un archivo titulado "Molview.mol" en la computadora. Asigne al archivo un nombre que tenga sentido y guárdelo en la carpeta que contiene el archivo pdb de proteínas.
13. Defina el área de búsqueda.
14. Defina el área en Webina como el bolsillo de unión de la proteína (SmcR) para facilitar el acoplamiento en la región correcta.
    NOTA: Las coordenadas para SmcR se proporcionan y generan utilizando el siguiente protocolo. Si se utiliza SmcR, se pueden omitir los pasos 2.15-2.20. El protocolo se puede adaptar para cualquier proteína con un bolsillo de unión al ligando conocido. Coordenadas: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. En AutoDock Tools, haga clic en Archivo → Leer molécula y abra el archivo de proteína pdb descargado en el paso 2.5.
16. Navegue hasta el panel de control y haga clic en la flecha azul junto al nombre de la proteína. Esto hará que aparezca una lista de cadenas. Haga clic en la flecha azul junto a una de las cadenas de proteínas.
17. Para resaltar los aminoácidos del bolsillo de unión, busque el aminoácido de interés en la lista que apareció. Junto al aminoácido, ve al triángulo en la columna Cl (color) en el extremo derecho. Haga clic en el triángulo y seleccione por arco iris.
    NOTA: Utilice este método para resaltar los siguientes aminoácidos:¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (si falta Met100, se puede omitir).
18. A continuación, haga clic en Grid → GridBox. Debe aparecer un cuadro sobre la estructura de la proteína con una cara roja, verde y azul. Antes de realizar cualquier cambio, cambie Espaciado (angstrom) a 1. Esto asegurará que el cuadro esté escalado correctamente para los siguientes pasos.
    1. A continuación, cambie los diales de la caja de la cuadrícula central para trasladar la caja en las direcciones x, y y z para colocarla sobre los aminoácidos resaltados. Haz clic y arrastra la proteína para rotar la estructura en tres dimensiones.
       NOTA: Esto ayudará a garantizar que la caja esté en la posición correcta. Si es necesario, utilice los tres diales superiores para el número de puntos para cambiar el tamaño de la caja.
19. Una vez que se establezcan la posición y las dimensiones de la caja, haga clic en Archivo → Cerrar Guardando Corriente.
20. En el menú, haga clic en Cuadrícula → Salida → Guardar GPF. Asigne un nombre al archivo y guárdelo en la misma carpeta que los dos archivos de estructura. Este archivo GPF tiene las coordenadas de la caja.
21. Realice el "Acoplamiento" en Webina para generar una energía de enlace calculada.
22. Abra la carpeta que contiene el archivo de ligando .mol y el archivo de proteína .pdb. Webina requiere archivos .pdbqt y realizará la conversión de archivos.
23. Vaya a Webina.
24. Receptor: Arrastre sobre el archivo descargado de la pdb llamado 3kz9.pdb. Haga clic en Agregar átomos de hidrógeno y haga clic en convertir. Haga clic en Aceptar en la siguiente ventana emergente para trabajar con un monómero.
25. Ligando: Arrastre sobre el archivo .mol para PTSP (u otro inhibidor de molécula pequeña). Asegúrese de que no haya casillas seleccionadas y haga clic en Convertir. Deje "Pose correcta" vacía y desplácese hacia abajo hasta la caja de acoplamiento. Introduzca los parámetros de caja apropiados (ya sean los enumerados anteriormente para SmcR o un conjunto generado por el protocolo en los pasos 2.15-2.20 para una proteína diferente).
26. Haga clic en Iniciar Webina y espere.
27. Se informará de una serie de energías de enlace calculadas [Afinidad (kcal/mol)] directamente debajo de una visualización de la molécula acoplada. Asegúrese de que el primer valor sea el más negativo.
28. Para visualizar el ligando acoplado en pymol u otro programa similar, descargue el archivo PDBQT de salida haciendo clic en el botón de descarga correspondiente. Este archivo es solo el ligando (PTSP) en las coordenadas acopladas.
29. Visualice el complejo ligando-SmcR acoplado en PyMol¹³.
    1. Descargue y abra PyMol.
       NOTA: Los estudiantes y educadores de tiempo completo pueden recibir una licencia de PyMol de forma gratuita. Cuando se le solicite una licencia después de iniciar PyMol por primera vez, haga clic en Comprar licencia. Seleccione Estudiante/Profesor.
    2. Abra el archivo pdb llamado 3kz9.pdb.
    3. Abra el archivo de salida pdbqt creado por Webina.
    4. Visualice la mejor conformación (la que tenga la menor afinidad de unión) haciendo clic en las pequeñas flechas que apuntan hacia afuera en la parte inferior derecha de la pantalla de PyMol. La primera conformación será la más favorable y se mostrará cuando se abra el archivo.
    5. Manipule la proteína con el ligando acoplado en PyMol usando comandos estándar¹⁴.
       NOTA: El estudio previo de Newman et al. comparó las afinidades de unión predichas de varios compuestos determinados por Webina con ensayos in vitro e in vivo ⁹. Estas afinidades de unión sirven como referencia para compuestos que probablemente sean buenos inhibidores con altas afinidades (que se correlacionan con números más bajos de kcal/mol) para el bolsillo de unión. Un ejemplo de los datos de salida de Webina se incluye en la Figura 3A,B para el enlace PTSP en el bolsillo de SmcR.

3. Evaluación biológica de las tiofenesulfonamidas en la inhibición de la detección de quórum

NOTA: Aquí se describe el procedimiento específico para analizar la proteína LuxR de Vibrio campbellii. Sin embargo, este procedimiento se puede adaptar para su uso con cualquiera de las proteínas Vibrio LuxR/HapR, todas las cuales están disponibles en plásmidos replicantes ectópicamente que son compatibles con el plásmido reportero pJV064⁹. El ensayo de "pantalla rojo-verde" se realiza en un fondo bacteriano heterólogo utilizando células de E. coli que contienen los dos plásmidos. El plásmido de expresión LuxR/HapR (que confiere resistencia a la kanamicina) está disponible expresando diferentes genes LuxR (Figura 4A). El plásmido pJV064 (que confiere resistencia al cloranfenicol) codifica un gen gfp bajo el control de un promotor activado por LuxR y un gen mCherry bajo el control de un promotor reprimido por LuxR (Figura 4A). Ambos promotores fueron elegidos debido a su identificación como genes regulados por LuxR con grandes cambios en la expresión in vivo¹⁵. Las cepas de E. coli LuxR/HapR y el plásmido pJV064 han sido publicados previamente ^9,15.

1. Preparación de medios líquidos: Prepare 1 L de medio LB.
   1. Pesa 10 g de NaCl, 10 g de bactotriptona y 5 g de extracto de levadura.
   2. Mezcle los componentes en un vaso de precipitados o en un cilindro graduado con una placa de agitación.
   3. Lleve el volumen total a 1 L utilizando cilindros graduados.
   4. Si lo desea, alícuota a 100 ml por frasco antes de esterilizar en autoclave.
   5. Autoclave durante 15 min por cada 1 L de medio. Alternativamente, si no se dispone de un autoclave, se puede utilizar un Instant Pot¹⁶.
2. Inoculación de la cepa (Día 1)
   1. Añadir antibióticos al medio LB a las concentraciones finales de kanamicina (40 μg/mL) y cloranfenicol (10 μg/mL).
   2. Alícuota 5 mL de medio LB/Kan40/CM10 en tubos de ensayo estériles con tapones.
   3. Inocular cepas de E. coli a partir de existencias congeladas: cultivo de E. coli que expresa LuxR/HapR y el plásmido pJV064 (LuxR+)^9,15; Cultivo de control de vector vacío de E. coli y plásmido pJV064 (LuxR-)^9,15.
   4. Agitar el cultivo durante la noche a 275 rpm a 30 °C durante 16-18 h.
3. Ensayo de tiofenesulfonamidas (Día 2)
   1. Pesa ~30 mg del compuesto. Resuspender a 100 mM en DMSO y vórtice para mezclar. A continuación, prepare un caldo de 10 mM.
   2. Mezcle 20 μL de material de 100 mM con 180 μL de DMSO para diluirlo (1:10) y obtener un material de trabajo de 10 mM. Vórtice para mezclar.
   3. Diluir a fondo el cultivo LuxR+ y los cultivos LuxR- (1:100) en 10 mL de medios LB/Kan/CM en tubos cónicos de 15 mL y vórtice brevemente para mezclar.
   4. Utilice una placa estéril de 96 pocillos negros, de fondo transparente, de 96 pocillos para el ensayo.
   5. Prepare una serie de diluciones para todas las columnas. Se incluye como referencia un diagrama de la serie de diluciones de 4 pliegues (Figura 4B).
      NOTA: Se recomienda una pipeta digital multicanal para este proceso. Este método es para una serie de diluciones de 4 veces (1:4). Sin embargo, se pueden utilizar diferentes series de dilución (p. ej., 1:10, 1:5).
      1. Pipetear 200 μL de la mezcla de cultivo LuxR+ en una placa de 96 pocillos en la fila A, 1-6 (Figura 4B; verde).
      2. Pipetear 200 μL de la mezcla de cultivo LuxR en una placa de 96 pocillos en la fila A, 7-12 (Figura 4B; naranja).
      3. Pipetear 150 μL de la mezcla de cultivo LuxR+ en una placa de 96 pocillos en las filas B-E, 1-6 (Figura 4B; verde).
      4. Pipetear 150 μL de la mezcla de cultivo LuxR en una placa de 96 pocillos en las filas B-E, 7-12 (Figura 4B; naranja).
      5. Agregue 2 μL del compuesto o DMSO a cada pocillo de la fila A de acuerdo con la Figura 4B.
      6. Para cada columna, pipetear hacia arriba y hacia abajo 3 veces, luego transfiera 50 μL de la fila A a la fila B, en la misma columna.
      7. Repita la mezcla y el pipeteo para las filas B, C, D, E. Después de mezclar la fila E, retire 50 μL y deseche. Al final, uno debe tener 150 μL en cada pocillo.
   6. Cubra la placa con cinta microporosa.
   7. Incubar la placa agitándola a 275 rpm a 30 °C durante la noche durante 16-18 h.
   8. Mida la fluorescencia y la densidad óptica de las placas de ensayo (día 3).
      1. Retire la cinta con cuidado y no derrame líquido fuera de los pozos.
      2. En un lector de placas, lea la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀), GFP y mCherry.
         NOTA: Se recomienda establecer una ganancia para ambos canales de fluorescencia a fin de permitir comparaciones entre ensayos.
   9. Registre los datos como fluorescencia normalizada por celda: GFP/OD₆₀₀ y mCherry/OD₆₀₀.
   10. Represente los datos, como se muestra en la figura 5, para ilustrar los resultados del control DMSO en comparación con las muestras de prueba.

4. Lavar las placas de ensayo negras para su reutilización

1. Remoja los platos en lejía.
   1. Etiquete un vaso de precipitados de plástico de 1 L como "residuo biológico". Vierta el líquido de los platos en este contenedor de residuos (limpie cuidadosamente las gotas con EtOH al 70%). Enjuague los platos con agua desionizada de la botella rociadora sobre los desechos y viértalos en ella.
   2. Etiquete otro vaso de precipitados de plástico de 1 litro como "30% de lejía". Coloque los platos/tapas en este recipiente y cúbralos con lejía al 30%. Envuelva la parte superior con una lámina de plástico y pese los platos con una caja de propinas o algo similar. Deje reposar sumergido en la solución de lejía durante la noche.
2. Enjuague y remoje en etanol.
   1. Enjuague bien los platos con agua desionizada en el fregadero para que no quede lejía. Vierte el agua restante de los pozos en el fregadero.
   2. Agregue 70% de EtOH a todos los pocillos y tapas con una botella rociadora. Deje que las placas se asienten en posición vertical con la tapa en la parte superior pero torcida para que el EtOH pueda evaporarse, pero nada cae en los pozos. Deje reposar el plato durante la noche.
3. Deje que los platos se sequen.
   1. Deseche el EtOH restante.
   2. Voltee el plato sobre una toalla de papel y deje que el resto del EtOH se evapore. Deje las placas de esta manera en una campana extractora. Las placas estarán listas para el próximo uso.

Resultados

Como resultados representativos, se incluyen datos de tres compuestos de tiofenesulfonamida sintetizados por estudiantes de pregrado para los compuestos 1A, 2B y 3B (Figura 5A-C; descrito en detalle en Newman et al.⁹). Cada compuesto se probó en la cepa de E. coli que expresa V. campbellii LuxR y utilizando el plásmido reportero pJV064. La fluorescencia normalizada por cé...

Discusión

Este CURE se desarrolló originalmente como un protocolo abreviado de dos etapas y tres semanas (diseño/síntesis y ensayo) y se implementó en cinco semestres como parte de un curso de laboratorio orgánico de nivel superior⁸. Desde el informe original, se agregó el módulo de modelado por computadora y el ensayo de E. coli se optimizó para investigadores novatos. El protocolo resultante de tres etapas y dos semestres se ha implementado tres veces com...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract