Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio

Resumen

Los compuestos de tiofenesulfonamida son inhibidores potentes y específicos de los reguladores de detección LuxR /HapR que bloquean su actividad in vivo, evitando así la transcripción de genes de virulencia, motilidad y biopelículas. Este protocolo detalla cómo se sintetizan, modelan in silico y analizan in vivo estos compuestos para determinar su actividad frente a LuxR/HapR.

Resumen

Las bacterias detectan el número de poblaciones locales mediante la detección de quórum, un método de comunicación célula a célula ampliamente utilizado para controlar los comportamientos bacterianos. En las especies de Vibrio , los reguladores maestros de detección de quórum LuxR/HapR controlan cientos de genes de detección de quórum, muchos de los cuales influyen en la virulencia, el metabolismo, la motilidad y más. Las tiofenesulfonamidas son potentes inhibidores de LuxR/HapR que se unen al bolsillo del ligando en estos factores de transcripción y bloquean la expresión génica de detección de quórum posterior. Esta clase de compuestos sirvió como base para el desarrollo de un conjunto de procedimientos simples, robustos y educativos para que los estudiantes universitarios asimilaran sus habilidades de química y biología utilizando un modelo CURE: experiencia de investigación de pregrado basada en cursos. Se describen protocolos optimizados que comprenden tres etapas de aprendizaje en una plataforma iterativa y multidisciplinaria para involucrar a los estudiantes en un CURE de un año de duración: (1) diseñar y sintetizar nuevos inhibidores de moléculas pequeñas basados en el núcleo de tiofenesulfonamida, (2) utilizar el modelado estructural para predecir la afinidad de unión al objetivo, y (3) analizar la eficacia de los compuestos en ensayos microbiológicos contra proteínas específicas de Vibrio LuxR/HapR. El ensayo reportero descrito realizado en E. coli predice con éxito la eficacia de los compuestos contra las proteínas objetivo en las especies nativas de Vibrio .

Introducción

Las bacterias detectan la densidad de población y el tipo de células cercanas mediante un proceso de comunicación célula a célula llamado detección de quórum (QS)¹. Diversos clados de bacterias utilizan QS para controlar diversos comportamientos, como la motilidad, la formación de biopelículas, la secreción de factores de virulencia, etc. Las proteínas y señales involucradas en el QS difieren ampliamente entre las bacterias. En las especies de Vibrio , el sistema de señalización QS utiliza predominantemente receptores híbridos de histidina-quinasa unidos a la membrana que reconocen señales específicas ....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño y síntesis de bibliotecas de tiofenesulfonamida

NOTA: Los inhibidores de la tiofenesulfonamida como el 3-fenil-1-(tiofen-2-ilsulfonil)-1 H-pirazol (PTSP) se sintetizan a través de la condensación promovida por la base en un solo paso ^8,9, como se muestra en la Figura 2. Para diseñar nuevas bibliotecas de compuestos para el estud....

Discusión

Este CURE se desarrolló originalmente como un protocolo abreviado de dos etapas y tres semanas (diseño/síntesis y ensayo) y se implementó en cinco semestres como parte de un curso de laboratorio orgánico de nivel superior⁸. Desde el informe original, se agregó el módulo de modelado por computadora y el ensayo de E. coli se optimizó para investigadores novatos. El protocolo resultante de tres etapas y dos semestres se ha implementado tres veces com.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract