تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

Summary

يصف هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية لإعداد عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي ، مع التركيز على السمات الهيكلية لمحطات المستقبلات الضوئية لشبكية العين.

Abstract

ظهر المجهر الإلكتروني الحجمي (Volume EM) كأداة قوية لتصور الهيكل ثلاثي الأبعاد للخلايا والأنسجة بدقة على مستوى النانومتر. داخل شبكية العين ، تنشئ أنواع مختلفة من الخلايا العصبية روابط متشابكة في طبقات الضفيرة الداخلية والخارجية. في حين أن تقنيات EM التقليدية قد أسفرت عن رؤى قيمة حول عضيات الشبكية تحت الخلوية ، فإن قيودها تكمن في توفير بيانات صورة ثنائية الأبعاد ، والتي يمكن أن تعيق القياسات الدقيقة. على سبيل المثال ، يعد تحديد حجم ثلاثة تجمعات حويصلية متشابكة متميزة ، وهي ضرورية للانتقال المشبكي ، أمرا صعبا في 2D. يوفر Volume EM حلا من خلال توفير بيانات ثلاثية الأبعاد واسعة النطاق وعالية الدقة. تجدر الإشارة إلى أن تحضير العينة هو خطوة حاسمة في Volume EM ، مما يؤثر بشكل كبير على وضوح الصورة وتباينها. في هذا السياق ، نحدد بروتوكول تحضير العينة لإعادة بناء 3D لمحطات محورية المستقبلات الضوئية في شبكية العين. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات رئيسية: تشريح شبكية العين وتثبيتها ، وعمليات تضمين العينة ، واختيار مجال الاهتمام.

Introduction

شبكية العين مليئة بالمحاور العصبية المتشابكة والتشعبات التي تشكل نقاط الاشتباك العصبي^{بينهما 1}. الفحص المجهري هو أداة لا غنى عنها لدراسة تشريح الشبكية لأنه يحتوي على هياكل دقيقة ومعقدة وصغيرة. على الرغم من أن المجهر الإلكتروني (EM) يوفر قوة لا مثيل لها للتحقيق في البنية التحتية للعضيات تحت الخلوية والتوطين الدقيق لبروتينات معينة على مستوى النانومتر² ، إلا أنه ينتج صورا تقتصر على المستوى ثنائي الأبعاد (2D) ، مما يؤدي إلى فقدان محتمل للمعلومات الأساسية.

يدعم تطوير تقنيات المجهر الإلكتروني عالية الدقة (Volume EM) توفير معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) أكثر شمولا وأوسع نطاقا. تمت مراجعة بعض طرق 3D EM مؤخرا من قبل آخرين^3،4،5. يسمح 3D EM بإعادة بناء الشكل العصبي وتفاصيل الاتصال ، مما يتيح التحليل الكمي الدقيق للهياكل ذات الأهمية. يوضح هذا أن البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة الحجم EM أكثر منهجية واكتمالا ودقة.

المستقبلات الضوئية للشبكية ، التي تشكل الخلايا العصبية الأولية في الإشارات البصرية^6،7 ، تنشئ نقاط الاشتباك العصبي مع تشعبات الخلايا ثنائية القطب والأفقية من الدرجة الثانية في طرف المستقبلات الضوئية لتسهيل الإشارات المثيرة^8،9. تشمل هذه المحطات ، التي يشار إليها باسم العنق المخروطية وكرات القضيب ، ثلاثة مكونات حاسمة: الميتوكوندريا ، والأشرطة المشبكية ، والحويصلات المتشابكة. في حين أن الدراسات السابقة ركزت في الغالب على الهيكل العام لمشابك الشريط ، كان هناك غياب ملحوظ للتحقيق في البنية الدقيقة للمكونات الرئيسية ، بما في ذلك الميتوكوندريا والشريط وبرك الحويصلات وتنظيمها المكاني في المحطات^{10،11،12،13}. يعد التحليل الدقيق والمنهجي لكل مكون ، جنبا إلى جنب مع فهم ارتباطها داخل محطات المستقبلات الضوئية ، أمرا حيويا لكشف التنظيم المكاني واستيعاب وظائف المعالجة المرئية بشكل شامل. في المستقبلات الضوئية ، توجد الميتوكوندريا بشكل أساسي في الجزء الداخلي وجسم الخلية والمحطة. ركزنا هنا على الميتوكوندريا في المستقبلات الضوئية الطرفية. الفحص المجهري الإلكتروني لمسح الحزمة الأيونية المركزة (FIB-SEM) ، وهو نوع من الحجم EM يتميز بدقة عالية (دقة x و y و z < 5 نانومتر) وتدفق حجم كبير نسبيا^4،14 ، بمثابة أداة قوية لتصور الهيكل ثلاثي الأبعاد لمحطات المستقبلات الضوئية بدقة.

كل من FIB-SEM والمجهر الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM) هما حجم EM يعتمد على SEM للحصول على صورة الأنسجة عن طريق مسح سطح العينة. يتم الكشف عن ميزات البنية التحتية لسطح العينة من خلال التباين الناتج عن شدة الإلكترونات الثانوية أو المتناثرة (BSE) عندما تقوم حزمة الإلكترون بمسح العينة¹⁵. بشكل أساسي ، يسمح الكشف عن مرض جنون البقر أو الإلكترونات الثانوية من سطح المقطع العرضي لعينة الأنسجة المضمنة في الراتنج في SEM بالحصول على صور للعينة المدمجة^16،17. عندما يكون مرض جنون البقر أو الإلكترونات الثانوية أقل إنتاجا ، لا يمكن الحصول إلا على معلومات على سطح العينة. يتطلب تحقيق تباين متسق وصور تسلسلية عالية الجودة ترسب كاف للمعادن الثقيلة في العينة. لذلك ، تعد بروتوكولات إعداد العينات المحددة ضرورية للتجزئة اللاحقة ، وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، والتحليل عند استخدام SEM للتصوير التسلسلي. طريقة الأوزميوم - ثيوكاربوهيدرازيد - أوزميوم (OTO) هي مخطط نموذجي لإعداد العينة للفحص المجهري الإلكتروني ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية ، مع الحفاظ على بنية الأغشية المحتوية على الدهون والحفاظ على تباين جيد^18،19.

هنا ، قمنا بتطوير طريقة OTO لإعداد عينات الشبكية لاستخدام Volume EM. تركز هذه العملية بشكل خاص على تشريح شبكية العين ، وتحديد وقت التثبيت الأمثل لأنسجة الشبكية ، وتفصيل الإجراءات والاحتياطات المحددة في إعداد العينة ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التجزئة وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد للهيكل المستهدف خطوات أساسية في هذا التطبيق الموسع. تتطلب شبكية العين ، كونها هيكلا صغيرا وصعبا للحصول على المواد منه ، عمليات سريعة ودقيقة ل EM ، مع أوقات ثابتة وكواشف جديدة معدة للاستخدام الفوري.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات رعاية واستخدامه من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة ونتشو الطبية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO). تم الحفاظ على جميع الفئران في دورة إضاءة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة وزودت بنظام غذائي قياسي.

1. تشريح الشبكية وتثبيتها

1. تخدير الفئران (C57BL / 6J ، ذكر ، 8 أسابيع ، 20-25 جم) عن طريق حقن 2،2،2-ثلاثي البروم إيثانول (0.25 مجم / غرام من وزن الجسم) داخل الصفاق. تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم تراجع المخلب الخلفي بعد الضغط على إصبع القدم أو عدم وجود رد فعل وامض. ثم خلع فقرة عنق الرحم بينما لا تزال تحت التخدير للقتل الرحيم للحيوان.
   ملاحظة: تم اختيار ثلاثي بروموإيثانول لفعاليته الموثقة جيدا في إحداث تخدير سريع وموثوق به في نماذج الصغيرة ، خاصة بالنسبة للإجراءات قصيرة المدى. في حين أن التخدير الصيدلاني مفضل ، فإن ثلاثي بروموإيثانول يوفر مزايا محددة في بروتوكولات معينة ، مما يجعله بديلا مناسبا عند تحضيره وإدارته بشكل صحيح. تم اتخاذ جميع الاحتياطات لضمان استخدامه الآمن والفعال. تلتزم هذه الدراسة بالاعتبارات الأخلاقية من خلال ضمان الإعداد والإدارة والمراقبة المناسبة للتخفيف من المخاطر المحتملة المرتبطة باستخدامها.
2. قم بإزالة العينين بمقص منحني واغمر العينين في محلول مختلط يحتوي على 2٪ جلوتارالديهايد و 2٪ بارافورمالدهيد في مخزن الفوسفات (PB ، 0.1 م ، درجة الحموضة 7.4).
3. قم بإزالة الجزء الأمامي والجسم الزجاجي من العينين باستخدام ملقط تحت مجهر التشريح.
4. قشر الصلبة بالملقطين حتى يتم عزل الشبكية تماما عن كوب العين.
5. قم بتقطيع شبكية العين بسرعة إلى شرائح بسمك 100 - 200 ميكرومتر باستخدام ماكينة حلاقة وتعامل مع شرائط شبكية العين بماصة باستور في أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق (EP) يحتوي على 2٪ جلوتارالديهايد و 2٪ بارافورمالدهيد في عازلة الفوسفات (PB ، 0.1 M ، درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) على المدور. بعد الانتهاء ، ضع الأنابيب لتثبيتها عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

2. عملية تضمين العينة

1. بعد الغسيل في 0.1 M cacodylate buffer (الرقم الهيدروجيني 7.4) 5 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها ، احتضان شرائط شبكية العين بمحلول يحتوي على 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم و 1٪ OsO₄ (في PB ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في 0.1 M cacodylate الصوديوم مع 4 ملي CaCl₂ لمدة 1.5 ساعة في الظلام على الجليد.
   ملاحظة: يمكن أن تمنع الحضانة المظلمة ونقص الفوسفات هطول الأمطار والتحف في العينة.
2. اغسل شرائط شبكية العين 3 مرات في ddH₂O لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم عالجها بنسبة 1٪ ثيوكاربوهيدرازيد في ddH₂O لمدة 30 دقيقة في الظلام في RT.
3. بعد الشطف في ddH₂O 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها ، قم باحتضان شرائط شبكية العين في 2٪ OsO4 (في PB ، PH 7.4) لمدة 45 دقيقة في الظلام في RT.
4. بعد الغسيل في ddH₂O 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما ، اغمر شرائح شبكية العين في أسيتات اليورانيل المائية بنسبة 1٪ في الظلام عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
5. في اليوم التالي ، بعد الغسيل في ddH₂O 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها ، عالج شرائط شبكية العين بنسبة 0.66٪ نترات الرصاص في حمض الأسبارتيك (0.03 م ، درجة الحموضة 5.5) لمدة 40 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
6. بعد الغسيل في ddH₂O 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها ، قم بتجفيف شرائط شبكية العين بتركيز الإيثانول الصاعد بنسبة 30٪ و 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ لمدة 20 دقيقة في كل محلول.
7. عالج شرائح شبكية العين بمحلول مختلط يحتوي على الإيثانول والأسيتون المتساوي لمدة 20 دقيقة ، متبوعا بغسل الأسيتون مرتين لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
8. تسلل إلى شرائط شبكية العين في الأسيتون / الراتنج الممزوج بنسبة 7: 3 في الظلام في RT بين عشية وضحاها ثم الأسيتون / الراتنج عند 3: 7 في الظلام لمدة 24 ساعة في RT.
   ملاحظة: التركيب الدقيق للراتنج هو كما يلي: Epon812 10.06 مل ، DDSA 4 مل ، MNA 5.94 مل ، و DMP-30 0.2 مل.
9. قم بتغيير الأنابيب في اليوم التالي وتسلل إلى شرائط شبكية العين براتنج نقي لمدة 24 ساعة عند 45 درجة مئوية. قم بتغيير الراتنج مرة أخرى في اليوم التالي ، وقم بتضمين شرائط شبكية العين لمدة 48 ساعة عند 60 درجة مئوية.
   ملاحظة: الغرض من زيادة درجة الحرارة هو تحسين الاختراق.

3. اختيار مجال الاهتمام

1. قم بتقطيع كتل الراتنج إلى أقسام بسمك 1 ميكرومتر ، وأقسام تلطيخ ب 1٪ تولويدين أزرق ، وراقب الهيكل العام لشبكية العين تحت المجهر الضوئي لتحديد المناطق الخشنة ذات الأهمية.
2. قم بتغطية كتل الراتنج بالبلاتين باستخدام طلاء الرش ، متبوعا بالطحن بقسم بسمك 70 نانومتر باستخدام مجهر إلكتروني ماسح شعاع أيوني مركز تحت تيار 0.23 نانوأمبير وجهد تسارع يبلغ 30 كيلو فولت.
3. قم بفحص القسم مسبقا باستخدام FIB-SEM بتكبير 2000x لتحديد مناطق الاهتمام الدقيقة.
4. اجمع البيانات باستخدام FIB-SEM بتيار شعاع 0.69 نانوأمبير وجهد تسارع 2 كيلو فولت. المعلمات الأخرى هي كما يلي: وقت السكون = 2 ميكرو ثانية ، حجم فوكسل = 1.8 نانومتر × 1.8 نانومتر × 15 نانومتر.

النتائج

يوضح الشكل 1 أ صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة التثبيت المزدوج الكيميائي التقليدية ، ويوضح الشكل 1 ب صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة OTO. تم أخذ عينات من كلاهما بواسطة FIB-SEM. يمكن مل...

Discussion

قمنا بتنفيذ بروتوكول تحضير عينة حجم EM الخاص ب OTO لتحليل البنية الطرفية للمستقبلات الضوئية في أنسجة الشبكية. كان التركيز على تفصيل الإجراء بأكمله ، بدءا من انفصال شبكية العين وتثبيتها إلى عرض نتائج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمحطات المحور العصبي المستقبلة للضوء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049