تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

Summary

يصف هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية لإعداد عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي ، مع التركيز على السمات الهيكلية لمحطات المستقبلات الضوئية لشبكية العين.

Abstract

ظهر المجهر الإلكتروني الحجمي (Volume EM) كأداة قوية لتصور الهيكل ثلاثي الأبعاد للخلايا والأنسجة بدقة على مستوى النانومتر. داخل شبكية العين ، تنشئ أنواع مختلفة من الخلايا العصبية روابط متشابكة في طبقات الضفيرة الداخلية والخارجية. في حين أن تقنيات EM التقليدية قد أسفرت عن رؤى قيمة حول عضيات الشبكية تحت الخلوية ، فإن قيودها تكمن في توفير بيانات صورة ثنائية الأبعاد ، والتي يمكن أن تعيق القياسات الدقيقة. على سبيل المثال ، يعد تحديد حجم ثلاثة تجمعات حويصلية متشابكة متميزة ، وهي ضرورية للانتقال المشبكي ، أمرا صعبا في 2D. يوفر Volume EM حلا من خلال توفير بيانات ثلاثية الأبعاد واسعة النطاق وعالية الدقة. تجدر الإشارة إلى أن تحضير العينة هو خطوة حاسمة في Volume EM ، مما يؤثر بشكل كبير على وضوح الصورة وتباينها. في هذا السياق ، نحدد بروتوكول تحضير العينة لإعادة بناء 3D لمحطات محورية المستقبلات الضوئية في شبكية العين. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات رئيسية: تشريح شبكية العين وتثبيتها ، وعمليات تضمين العينة ، واختيار مجال الاهتمام.

Introduction

شبكية العين مليئة بالمحاور العصبية المتشابكة والتشعبات التي تشكل نقاط الاشتباك العصبي^{بينهما 1}. الفحص المجهري هو أداة لا غنى عنها لدراسة تشريح الشبكية لأنه يحتوي على هياكل دقيقة ومعقدة وصغيرة. على الرغم من أن المجهر الإلكتروني (EM) يوفر قوة لا مثيل لها للتحقيق في البنية التحتية للعضيات تحت الخلوية والتوطين الدقيق لبروتينات معينة على مستوى النانومتر² ، إلا أنه ينتج صورا تقتصر على المستوى ثنائي الأبعاد (2D) ، مما يؤدي إلى فقدان محتمل للمعلومات الأساسية.

يدعم تطوير تقنيات المجهر الإلكتروني عالية الدقة (Volume EM) توفير معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد....

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات رعاية واستخدامه من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة ونتشو الطبية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO). تم الحفاظ على جميع الفئران في دورة إضاءة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة وزودت بنظام غذائي قياسي.

1. تشريح الشبكية وتثبيتها

1. تخدير الفئران (C57BL / 6J ، ذكر ، 8 أسابيع ، 20-25 جم) عن طريق حقن 2،2،2-ثلاثي البروم إيثانول (0.25 مجم / غرام من وزن الجسم) داخل الصفاق. تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم تراجع المخلب الخلفي بعد الضغط على إصبع القدم أو عدم وجود رد فعل وامض. ثم خلع فقرة عنق الرحم بينما لا تزال تحت التخدير للقتل الرحيم للحيوان.
   ملاح....

النتائج

يوضح الشكل 1 أ صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة التثبيت المزدوج الكيميائي التقليدية ، ويوضح الشكل 1 ب صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة OTO. تم أخذ عينات من كلاهما بواسطة FIB-SEM. يمكن مل.......

Discussion

قمنا بتنفيذ بروتوكول تحضير عينة حجم EM الخاص ب OTO لتحليل البنية الطرفية للمستقبلات الضوئية في أنسجة الشبكية. كان التركيز على تفصيل الإجراء بأكمله ، بدءا من انفصال شبكية العين وتثبيتها إلى عرض نتائج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمحطات المحور العصبي المستقبلة للضوء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049