Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Özet

Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.

Özet

Hacim elektron mikroskobu (Volume EM), hücrelerin ve dokuların 3D yapısını nanometre düzeyinde hassasiyetle görselleştirmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Retina içinde, çeşitli nöron türleri iç ve dış pleksiform tabakalarda sinaptik bağlantılar kurar. Konvansiyonel EM teknikleri retina hücre altı organelleri hakkında değerli bilgiler vermiş olsa da, sınırlamaları, doğru ölçümleri engelleyebilecek 2D görüntü verileri sağlamada yatmaktadır. Örneğin, sinaptik iletim için çok önemli olan üç farklı sinaptik vezikül havuzunun boyutunu ölçmek 2D'de zordur. Volume EM, büyük ölçekli, yüksek çözünürlüklü 3D veriler sağlayarak bir çözüm sunar. Numune hazırlamanın Hacim EM'de kritik bir adım olduğunu ve görüntü netliğini ve kontrastını önemli ölçüde etkilediğini belirtmekte fayda var. Bu bağlamda, retinadaki fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonu için bir numune hazırlama protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol üç temel adımı içerir: retina diseksiyonu ve fiksasyonu, örnek yerleştirme işlemleri ve ilgi alanının seçimi.

Giriş

Retina, aralarında sinaps oluşturan iç içe geçmiş nöronal aksonlar ve dendritlerle yoğun bir şekilde doludur¹. Mikroskopi, ince, karmaşık ve küçük yapılara sahip olduğu için retina anatomisini incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Elektron mikroskobu (EM), hücre altı organellerin üst yapısını ve nanometre seviye^2'de spesifik proteinlerin doğru lokalizasyonunu araştırmak için benzersiz bir güç sağlasa da, iki boyutlu (2D) düzlemle sınırlı görüntüler üretir ve bu da potansiyel anahtar bilgi kaybına yol açar.

Ortaya çıkan yüksek çözünürlüklü hacim elektron mikr....

Protokol

Hayvan bakımı ve kullanım protokolleri, Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından belirlenen yönergeleri takip etti. Tüm fareler 12 saatlik aydınlık ve 12 saatlik karanlık döngüde tutuldu ve standart bir yemek diyeti ile sağlandı.

1. Retina diseksiyonu ve fiksasyonu

1. Fareleri (C57BL / 6J, Erkek, 8 haftalık, 20-25 g) intraperitoneal olarak 2,2,2-tribromoetanol (0.25 mg / g vücut ağırlığı) enjekte ederek uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra arka pençeyi geri çekmeyerek veya göz kırpma refleksi....

Tartışmalar

Retina dokusundaki fotoreseptörlerin terminal yapısını analiz etmek için OTO'nun Volume EM numune hazırlama protokolünü uyguladık. Odak noktası, retinanın ayrılması ve sabitlenmesinden başlayarak, fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonunun sonuçlarını sergilemeye kadar tüm prosedürün detaylandırılmasıydı.

Retina dokusunun ayırt edici özelliği, beyin dokusundan farklı olarak, bölgesel farklılıkların olmamasıdır.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049