JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.

Özet

Hacim elektron mikroskobu (Volume EM), hücrelerin ve dokuların 3D yapısını nanometre düzeyinde hassasiyetle görselleştirmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Retina içinde, çeşitli nöron türleri iç ve dış pleksiform tabakalarda sinaptik bağlantılar kurar. Konvansiyonel EM teknikleri retina hücre altı organelleri hakkında değerli bilgiler vermiş olsa da, sınırlamaları, doğru ölçümleri engelleyebilecek 2D görüntü verileri sağlamada yatmaktadır. Örneğin, sinaptik iletim için çok önemli olan üç farklı sinaptik vezikül havuzunun boyutunu ölçmek 2D'de zordur. Volume EM, büyük ölçekli, yüksek çözünürlüklü 3D veriler sağlayarak bir çözüm sunar. Numune hazırlamanın Hacim EM'de kritik bir adım olduğunu ve görüntü netliğini ve kontrastını önemli ölçüde etkilediğini belirtmekte fayda var. Bu bağlamda, retinadaki fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonu için bir numune hazırlama protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol üç temel adımı içerir: retina diseksiyonu ve fiksasyonu, örnek yerleştirme işlemleri ve ilgi alanının seçimi.

Giriş

Retina, aralarında sinaps oluşturan iç içe geçmiş nöronal aksonlar ve dendritlerle yoğun bir şekilde doludur1. Mikroskopi, ince, karmaşık ve küçük yapılara sahip olduğu için retina anatomisini incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Elektron mikroskobu (EM), hücre altı organellerin üst yapısını ve nanometre seviye2'de spesifik proteinlerin doğru lokalizasyonunu araştırmak için benzersiz bir güç sağlasa da, iki boyutlu (2D) düzlemle sınırlı görüntüler üretir ve bu da potansiyel anahtar bilgi kaybına yol açar.

Ortaya çıkan yüksek çözünürlüklü hacim elektron mikroskobu (Volume EM) tekniklerinin geliştirilmesi, daha kapsamlı ve daha büyük ölçekli üç boyutlu (3D) yapısal bilgilerin sağlanmasını desteklemektedir. Bazı 3D EM yöntemleri yakın zamanda diğerleri tarafından gözden geçirilmiştir 3,4,5. 3D EM, nöronal şekil ve bağlantı detaylarının yeniden yapılandırılmasına izin vererek, ilgilenilen yapıların hassas kantitatif analizini mümkün kılar. Bu, hacim EM tarafından elde edilen verilerin daha sistematik, eksiksiz ve doğru olduğunu göstermektedir.

Görsel sinyallemede 6,7 ilk nöronları oluşturan retinal fotoreseptörler, uyarıcı sinyalleri 8,9 kolaylaştırmak için fotoreseptörün terminalinde ikinci dereceden bipolar ve yatay hücrelerin dendritleri ile sinapslar oluşturur. Koni pedikülleri ve çubuk küreleri olarak adlandırılan bu terminaller, üç önemli bileşeni kapsar: mitokondri, sinaptik şeritler ve sinaptik veziküller. Önceki çalışmalar ağırlıklı olarak şerit sinapslarının genel yapısı üzerine odaklanmış olsa da, mitokondri, şerit, vezikül havuzları ve bunların terminal10,11,12,13'teki uzamsal organizasyonları dahil olmak üzere ana bileşenlerin ince yapısı hakkında kayda değer bir araştırma eksikliği olmuştur. Her bir bileşenin kesin ve sistematik bir analizi, fotoreseptör terminalleri içindeki ilişkilerinin anlaşılması ile birlikte, mekansal organizasyonu çözmek ve görsel işleme işlevlerini kapsamlı bir şekilde kavramak için hayati önem taşır. Fotoreseptörlerde, mitokondri esas olarak iç segmentte, hücre gövdesinde ve terminalde bulunur. Burada terminal fotoreseptörlerdeki mitokondriye odaklandık. Yüksek çözünürlüğe (x, y ve z çözünürlüğü < 5 nm) ve nispeten büyük bir hacim akısına 4,14 sahip bir hacim EM türü olan odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM), fotoreseptör terminallerinin 3D yapısını doğru bir şekilde görselleştirmek için güçlü bir araçtır.

Hem FIB-SEM hem de Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu (SBF-SEM), numunenin yüzeyini tarayarak dokuların görüntüsünü elde etmek için SEM'e dayalı Hacim EM'dir. Bir numunenin yüzeyinin ultrastrüktürel özellikleri, elektron ışını numuneyi15 taradığında ikincil veya geri saçılan elektronların (BSE) yoğunluğu tarafından oluşturulan kontrast yoluyla ortaya çıkar. Esasen, SEM'de reçineye gömülü bir doku numunesinin enine kesit yüzeyinden BSE veya ikincil elektronların tespit edilmesi, gömülü numunenin16,17 görüntülerinin elde edilmesini sağlar. BSE veya ikincil elektronlar daha az üretildiğinde, numune yüzeyi hakkında bilgi yalnızca elde edilebilir. Tutarlı kontrast ve yüksek kaliteli seri görüntüler elde etmek, numunede yeterli miktarda ağır metal birikmesini gerektirir. Bu nedenle, seri görüntüleme için SEM kullanılırken sonraki segmentasyon, 3D rekonstrüksiyon ve analiz için özel numune hazırlama protokolleri çok önemlidir. Osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, biyolojik numunelerin 3D elektron mikroskobu için tipik bir numune hazırlama şemasıdır, lipid içeren zarların yapısını korur ve iyi kontrastı korur18,19.

Burada, Volume EM kullanımı için retina örneklerinin hazırlanması için OTO yöntemini geliştirdik. Bu işlem özellikle retinanın diseke edilmesine, retina dokusu için en uygun fiksasyon süresinin belirlenmesine ve 3D numune hazırlamada spesifik prosedürlerin ve önlemlerin detaylandırılmasına odaklanır. Ek olarak, hedef yapının segmentasyonu ve 3D rekonstrüksiyonu, bu genişletilmiş uygulamanın ayrılmaz adımlarıdır. Materyal elde etmek için küçük ve zorlu bir yapı olan retina, EM için hızlı ve hassas operasyonlar gerektirir, sabit süreler ve hemen kullanım için hazırlanmış taze reaktifler vardır.

Protokol

Hayvan bakımı ve kullanım protokolleri, Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından belirlenen yönergeleri takip etti. Tüm fareler 12 saatlik aydınlık ve 12 saatlik karanlık döngüde tutuldu ve standart bir yemek diyeti ile sağlandı.

1. Retina diseksiyonu ve fiksasyonu

  1. Fareleri (C57BL / 6J, Erkek, 8 haftalık, 20-25 g) intraperitoneal olarak 2,2,2-tribromoetanol (0.25 mg / g vücut ağırlığı) enjekte ederek uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra arka pençeyi geri çekmeyerek veya göz kırpma refleksi olmadan anestezinin derinliğini onaylayın. Ardından, hayvanı ötenazi yapmak için hala anestezi altındayken servikal omuru yerinden çıkarın.
    NOT: Tribromoetanol, özellikle kısa süreli prosedürler için küçük hayvan modellerinde hızlı ve güvenilir anesteziyi indüklemede iyi belgelenmiş etkinliği nedeniyle seçilmiştir. Farmasötik dereceli anestezikler tercih edilirken, tribromoetanol belirli protokollerde belirli avantajlar sunar, bu da onu uygun şekilde hazırlanıp uygulandığında uygun bir alternatif haline getirir. Güvenli ve etkin kullanımını sağlamak için tüm önlemler alınmıştır. Bu çalışma, kullanımıyla ilişkili potansiyel riskleri azaltmak için uygun hazırlık, uygulama ve izlemeyi sağlayarak etik hususlara bağlı kalmaktadır.
  2. Gözleri kavisli makasla çıkarın ve gözleri fosfat tamponunda (PB, 0.1 M, pH 7.4) %2 glutaraldehit ve %2 paraformaldehit içeren karışık bir çözeltiye daldırın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında forseps ile gözlerden ön segment ve vitreusu çıkarın.
  4. Retina vizör lastiğinden tamamen izole olana kadar sklerayı iki forseps ile soyun.
  5. Retinayı bir jiletle hızlı bir şekilde 100 - 200 μm kalınlığında şeritler halinde kesin ve retina şeritlerini bir Pasteur pipeti ile fosfat tamponunda (PB, 0.1 M, pH 7.4) %2 glutaraldehit ve %2 paraformaldehit içeren yeni bir mikrosantrifüj (EP) tüpüne tutun. Tamamlandıktan sonra, tüpleri 24 saat boyunca 4 °C'de sabitlemek için yerleştirin.

2. Örnek gömme işlemi

  1. 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.4) her biri 15 dakika boyunca 5 kez yıkadıktan sonra, retina şeritlerini% 1.5 potasyum ferrosiyanür ve% 1.5 OsO4 (PB, pH7.4 cinsinden) içeren bir çözelti ile 0.1 M sodyum kakodilat içinde 4 mM CaCl 2 ile karanlıkta 1.5 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Koyu inkübasyon ve fosfat eksikliği, numunede çökelmeyi ve artefaktları önleyebilir.
  2. Retina şeritlerini ddH2O'da her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve ardından RT'de karanlıkta 30 dakika boyunca ddH2O'da% 1 tiyokarbohidrazid ile tedavi edin.
  3. ddH2O'da her biri 15 dakika boyunca 3 kez duruladıktan sonra, retina şeritlerini RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca% 2 OsO4'te (PB, PH 7.4'te) inkübe edin.
  4. Her biri 15 dakika boyunca ddH2O 3 kez yıkadıktan sonra, retina şeritlerini gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de% 1 sulu uranil asetata daldırın.
  5. Ertesi gün, her biri 15 dakika boyunca ddH2O 3 kez yıkadıktan sonra, retina şeritlerini 65 ° C'de 40 dakika boyunca L-aspartik asit (0.03 M, pH 5.5) içinde% 0.66 kurşun nitrat ile tedavi edin.
  6. ddH2O'da her biri 15 dakika boyunca 3 kez yıkadıktan sonra, retina şeritlerini her solüsyonda 20 dakika boyunca% 30,% 50,% 70,% 90 ve% 100 artan etanol konsantrasyonu ile kurutun.
  7. Retina şeritlerine 20 dakika boyunca eşit etanol ve aseton içeren karışık bir çözelti uygulayın, ardından her biri 20 dakika boyunca 2 kez aseton yıkayın.
  8. Retina şeritlerini gece boyunca RT'de karanlıkta 7: 3 oranında karıştırılmış aseton / reçine içinde ve ardından RT'de 24 saat boyunca karanlıkta 3: 7'de aseton / reçine içinde sızın.
    NOT: Reçinenin kesin bileşimi aşağıdaki gibidir: Epon812 10.06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5.94 mL ve DMP-30 0.2 mL.
  9. Ertesi gün tüpleri değiştirin ve retina şeritlerini saf reçine ile 45 ° C'de 24 saat boyunca sızın. Ertesi gün reçineyi tekrar değiştirin ve retina şeritlerini 60 °C'de 48 saat boyunca gömün.
    NOT: Sıcaklığı artırmanın amacı penetrasyonu iyileştirmektir.

3. İlgi alanının seçimi

  1. Reçine bloklarını 1 μm kalınlığında bölümler halinde kesin, bölümleri %1 toluidin mavisi ile boyayın ve ilgilenilen pürüzlü bölgeleri seçmek için ışık mikroskobu altında retinanın genel yapısını gözlemleyin.
  2. Reçine bloklarını bir püskürtme kaplayıcı kullanarak platin ile kaplayın, ardından 0,23 nA akım ve 30 kV hızlanma voltajı altında odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu kullanarak 70 nm kalınlığında kesitli frezeleme yapın.
  3. Kesin ilgi alanlarını belirlemek için 2000x büyütmeli FIB-SEM kullanarak bölümü önceden tarayın.
  4. 0,69 nA ışın akımı ve 2 kV hızlanma voltajı ile FIB-SEM kullanarak verileri toplayın. Diğer parametreler aşağıdaki gibidir: bekleme süresi = 2 μs, voksel boyutu = 1.8 nm x 1.8 nm x 15 nm.

Sonuçlar

Şekil 1A'da geleneksel kimyasal çift fiksasyon yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü, Şekil 1B'de ise OTO yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü gösterilmektedir. Her ikisi de FIB-SEM ile örneklenmiştir. OTO yöntemi kullanılarak hücre zarı yapısının mümkün olduğunca korunabildiği ve hatta veziküllerin ana hatların?...

Tartışmalar

Retina dokusundaki fotoreseptörlerin terminal yapısını analiz etmek için OTO'nun Volume EM numune hazırlama protokolünü uyguladık. Odak noktası, retinanın ayrılması ve sabitlenmesinden başlayarak, fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonunun sonuçlarını sergilemeye kadar tüm prosedürün detaylandırılmasıydı.

Retina dokusunun ayırt edici özelliği, beyin dokusundan farklı olarak, bölgesel farklılıkların olmamasıdır...

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Anahtar Sinirbilim Laboratuvarı (SKLN-202103), Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019) Hibeleri ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
AcetoneElectron Microscopy Science10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon resinElectron Microscopy Science14900
EthanolSigma64-17-5
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEMFEI
L-aspartic acidSigma56-84-8
Lead nitrateSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2OSigma71507A component of phosphate buffer
OsO4TED PELLA4008-160501
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Potassium ferrocyanideSigma14459-95-1
Sodium cacodylateSigma6131-99-3
Sputter coaterLeicaACE200
ThiocarbohydrazideSigma2231-57-4
Uranyl acetateTED PELLACA96049

Referanslar

  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
  2. Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
  3. Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444 (2022).
  4. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
  7. Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
  8. Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
  9. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  10. Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
  11. Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
  12. Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944 (2011).
  13. Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024 (2016).
  14. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916 (2017).
  15. Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
  16. Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, 43-52 (1995).
  17. Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
  18. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
  19. Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
  20. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  21. Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600 (2020).
  24. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Retina rnekleriHacim Elektron Mikroskobu3D Rekonstr ksiyonFotoresept r Akson Terminallerirnek Haz rlamaRetina DiseksiyonuFiksasyonG mmelgi Alan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır