用于体电子显微镜检查的视网膜样品的制备

摘要

该协议描述了为体积电子显微镜制备视网膜样品的详细步骤，重点是视网膜感光器末端的结构特征。

摘要

体电子显微镜 （Volume EM） 已成为一种强大的工具，可以以纳米级的精度可视化细胞和组织的 3D 结构。在视网膜内，各种类型的神经元在内丛层和外丛状层建立突触连接。虽然传统的 EM 技术已经对视网膜亚细胞器产生了有价值的见解，但它们的局限性在于提供 2D 图像数据，这可能会阻碍准确测量。例如，量化三个不同突触囊泡池的大小对于突触传递至关重要，在 2D 中具有挑战性。Volume EM 通过提供大规模、高分辨率的 3D 数据来提供解决方案。值得注意的是，样品制备是体积电镜中的关键步骤，会显著影响图像清晰度和对比度。在这种情况下，我们概述了用于视网膜中感光器轴突末端 3D 重建的样品制备方案。该协议包括三个关键步骤：视网膜解剖和固定、样本包埋过程和感兴趣区域的选择。

引言

视网膜上密布着交织在一起的神经元轴突和树突，它们在它们之间形成突触¹。显微镜是研究视网膜解剖结构不可或缺的工具，因为它具有精细、复杂和微小的结构。尽管电子显微镜 （EM） 为研究亚细胞器的超微结构和纳米级特定蛋白质的准确定位提供了无与伦比的能力²，但它产生的图像仅限于二维 （2D） 平面，从而导致关键信息的潜在丢失。

新兴的高分辨率体电子显微镜 （Volume EM） 技术的发展支持提供更全面和更大规模的三维 （3D） 结构信息。一些 3D EM 方法最近被其他人审查了 ^3,4,5。3D EM 允许重建神经元形状和连接细节，从而能够对感兴趣的结构进行精确的定量分析。这表明 volume EM 获得的数据更加系统、完整和准确。

视网膜光感受器构成视觉信号传导中的初始神经元 ^6,7，^在感光器末端与二级双极和水平细胞的树突建立突触，以促进兴奋信号 ^8,9<....

研究方案

动物护理和使用方案由温州医科大学伦理委员会批准，并遵循视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 制定的指南。所有小鼠维持在 12 小时的光照和 12 小时的黑暗循环中，并提供标准的食物饮食。

1. 视网膜清扫和固定

1. 通过腹膜内注射 2,2,2-三溴乙醇（0.25 mg/g 体重）麻醉小鼠 （C57BL/6J，雄性，8 周龄，20-25 g）。通过捏住脚趾后后爪没有缩回或没有眨眼反射来确认麻醉深度。然后，在麻醉下脱臼颈椎以对动物实施安乐死。
   注意：选择三溴乙醇是因为其在小动物模型中诱导快速可靠麻醉的有据可查的功效，特别是对于短期手术。虽然首选药物级麻醉剂，但三溴乙醇在某些方案中具有特定的优势，如果制备和管理得当，使其成为合适的替代品。已采取一切预防措施以确保其安全有效地使用。本研究通过确保适当的准备、管理和监测来减轻与其使用相关的潜在风险，从而遵守道德考虑。
2. 用弯曲的剪刀去除眼睛，然后将眼睛浸入含有 2% 戊二醛和 2% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PB，0.1 M，pH 7.4）的混合溶液中。
3. 在解剖显微镜下用镊子从眼睛中取出眼前段和玻璃体。
4. 用两个镊子剥开巩膜，直到视网膜与眼罩完全分离。
5. 用剃须刀将视网膜快速切成 100 - 200 μm 厚的条带，然后用巴斯德移液管将视网膜条带....

讨论

我们实施了 OTO 的 Volume EM 样品制备方案来分析视网膜组织中光感受器的末端结构。重点是详细介绍整个过程，从视网膜的分离和固定开始，到展示感光器轴突末端的 3D 重建结果。

与脑组织不同，视网膜组织的显着特征在于它没有区域差异。视网膜由三层神经元细胞体和两层突触连接组成，尽管其神经元和突触成分很复杂，但视网膜仍表现出规则和?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049