用于体电子显微镜检查的视网膜样品的制备

摘要

该协议描述了为体积电子显微镜制备视网膜样品的详细步骤，重点是视网膜感光器末端的结构特征。

摘要

体电子显微镜 （Volume EM） 已成为一种强大的工具，可以以纳米级的精度可视化细胞和组织的 3D 结构。在视网膜内，各种类型的神经元在内丛层和外丛状层建立突触连接。虽然传统的 EM 技术已经对视网膜亚细胞器产生了有价值的见解，但它们的局限性在于提供 2D 图像数据，这可能会阻碍准确测量。例如，量化三个不同突触囊泡池的大小对于突触传递至关重要，在 2D 中具有挑战性。Volume EM 通过提供大规模、高分辨率的 3D 数据来提供解决方案。值得注意的是，样品制备是体积电镜中的关键步骤，会显著影响图像清晰度和对比度。在这种情况下，我们概述了用于视网膜中感光器轴突末端 3D 重建的样品制备方案。该协议包括三个关键步骤：视网膜解剖和固定、样本包埋过程和感兴趣区域的选择。

引言

视网膜上密布着交织在一起的神经元轴突和树突，它们在它们之间形成突触¹。显微镜是研究视网膜解剖结构不可或缺的工具，因为它具有精细、复杂和微小的结构。尽管电子显微镜 （EM） 为研究亚细胞器的超微结构和纳米级特定蛋白质的准确定位提供了无与伦比的能力²，但它产生的图像仅限于二维 （2D） 平面，从而导致关键信息的潜在丢失。

新兴的高分辨率体电子显微镜 （Volume EM） 技术的发展支持提供更全面和更大规模的三维 （3D） 结构信息。一些 3D EM 方法最近被其他人审查了 ^3,4,5。3D EM 允许重建神经元形状和连接细节，从而能够对感兴趣的结构进行精确的定量分析。这表明 volume EM 获得的数据更加系统、完整和准确。

视网膜光感受器构成视觉信号传导中的初始神经元 ^6,7，^在感光器末端与二级双极和水平细胞的树突建立突触，以促进兴奋信号 ^8,9。这些末端被称为锥形蒂和杆状球，包含三个关键组成部分：线粒体、突触带和突触囊泡。虽然以前的研究主要集中在带状突触的一般结构上，但明显缺乏对主要成分的精细结构的研究，包括线粒体、带状突触、囊泡池及其在末端的空间组织^{10、11、12、13}.对每个成分进行精确和系统的分析，以及了解它们在感光器末端内的相互关联，对于解开空间组织和全面掌握视觉处理功能至关重要。在光感受器中，线粒体主要存在于内段、细胞体和末端。我们在这里专注于末端光感受器中的线粒体。聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 是一种体积 EM，具有高分辨率（x、y 和 z 分辨率< 5 nm）和相对较大的体积通量 ^4,14，是准确可视化感光器末端 3D 结构的有效工具。

FIB-SEM 和连续块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 都是基于 SEM 的体积电磁，用于通过扫描样品表面来获取组织图像。当电子束扫描样品时，通过二次或背散射电子 （BSE） 的强度产生的对比度来揭示样品表面的超微结构特征¹⁵。从本质上讲，在 SEM 中从树脂包埋的组织样品的横截面表面检测 BSE 或二次电子可以获得包埋样品的图像^16,17。当 BSE 或次级电子产生较少时，只能获得样品表面的信息。要获得一致的对比度和高质量的连续图像，需要在样品中充分沉积重金属。因此，在使用 SEM 进行连续成像时，特定的样品制备方案对于后续的分割、3D 重建和分析至关重要。锇-硫代碳酰肼-锇 （OTO） 方法是生物样品 3D 电子显微镜的典型样品制备方案，保留了含脂质膜的结构并保持良好的对比度^18,19。

在这里，我们开发了 OTO 方法，用于制备用于体积 EM 的视网膜样品。这个过程特别侧重于解剖视网膜，确定视网膜组织的最佳固定时间，并详细说明 3D 样品制备中的具体程序和预防措施。此外，目标结构的分割和 3D 重建是此扩展应用程序中不可或缺的步骤。视网膜是一个小而具有挑战性的结构，需要快速和精确的 EM 操作，并准备好固定的时间和新鲜的试剂以立即使用。

研究方案

动物护理和使用方案由温州医科大学伦理委员会批准，并遵循视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 制定的指南。所有小鼠维持在 12 小时的光照和 12 小时的黑暗循环中，并提供标准的食物饮食。

1. 视网膜清扫和固定

1. 通过腹膜内注射 2,2,2-三溴乙醇（0.25 mg/g 体重）麻醉小鼠 （C57BL/6J，雄性，8 周龄，20-25 g）。通过捏住脚趾后后爪没有缩回或没有眨眼反射来确认麻醉深度。然后，在麻醉下脱臼颈椎以对动物实施安乐死。
   注意：选择三溴乙醇是因为其在小动物模型中诱导快速可靠麻醉的有据可查的功效，特别是对于短期手术。虽然首选药物级麻醉剂，但三溴乙醇在某些方案中具有特定的优势，如果制备和管理得当，使其成为合适的替代品。已采取一切预防措施以确保其安全有效地使用。本研究通过确保适当的准备、管理和监测来减轻与其使用相关的潜在风险，从而遵守道德考虑。
2. 用弯曲的剪刀去除眼睛，然后将眼睛浸入含有 2% 戊二醛和 2% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PB，0.1 M，pH 7.4）的混合溶液中。
3. 在解剖显微镜下用镊子从眼睛中取出眼前段和玻璃体。
4. 用两个镊子剥开巩膜，直到视网膜与眼罩完全分离。
5. 用剃须刀将视网膜快速切成 100 - 200 μm 厚的条带，然后用巴斯德移液管将视网膜条带处理到含有 2% 戊二醛和 2% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PB，0.1 M，pH 7.4）的新微量离心机 （EP） 管中，在室温 （RT） 下在旋转器上放置 2 小时。完成后，将试管在 4 °C 下固定 24 小时。

2. 样本包埋过程

1. 在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7.4） 中洗涤 5 次，每次 15 分钟后，将视网膜条带与含有 1.5% 亚铁氰化钾和 1% OsO₄（在 PB 中，pH7.4）的溶液在 0.1 M 二甲胂酸钠和 4 mM CaCl₂ 中孵育 1.5 小时在黑暗中在冰上。
   注：暗孵育和缺乏磷酸盐可防止样品中出现沉淀和伪影。
2. 将视网膜条带在 ddH₂O 中洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后在室温下在黑暗中用 ddH₂O 中的 1% 硫代碳酰肼处理 30 分钟。
3. 在 ddH_{中冲洗 2}O 3 次，每次 15 分钟后，在 RT 下将视网膜条带在 2% OsO 4 （PB，PH 7.4） 中在黑暗中孵育 45 分钟。
4. 在 ddH 中洗涤₂O 3 次，每次 15 分钟后，将视网膜条带在 4 °C 的黑暗中浸入 1% 乙酸铀酰水中过夜。
5. 第二天，在 ddH_{中洗涤 2}O 3 次，每次 15 分钟后，在 65°C 下用 0.66% 硝酸铅的 L-天冬氨酸（0.03 M，pH 5.5）处理视网膜条带 40 分钟。
6. 在 ddH 中洗涤₂O 3 次，每次 15 分钟后，在每种溶液中用 30%、50%、70%、90% 和 100% 的乙醇浓度递增脱水视网膜条带 20 分钟。
7. 用含有等乙醇和丙酮的混合溶液处理视网膜条带 20 分钟，然后用丙酮洗涤 2 次，每次 20 分钟。
8. 将视网膜条带浸润在丙酮/树脂中，在 RT 下以 7：3 的比例在黑暗中混合过夜，然后在 RT 下以 3：7 的比例在黑暗中混合 24 小时。
   注：填料的精确组成如下：Epon812 10.06 mL、DDSA 4 mL、MNA 5.94 mL 和 DMP-30 0.2 mL。
9. 第二天更换试管，并在 45 °C 下用纯树脂浸润视网膜条带 24 小时。 第二天再次更换树脂，并在 60 °C 下将 Retina 条带包埋 48 小时。
   注意：提高温度的目的是提高渗透率。

3. 选择感兴趣的区域

1. 将树脂块切成 1 μm 厚的切片，用 1% 甲苯胺蓝染色切片，并在光学显微镜下观察视网膜的一般结构以选择感兴趣的粗糙区域。
2. 使用溅射涂布机在树脂嵌段上涂覆铂，然后使用聚焦离子束扫描电子显微镜在 0.23 nA 的电流和 30 kV 的加速电压下铣削 70 nm 厚的截面。
3. 使用具有 2000 倍放大倍率的 FIB-SEM 对切片进行预筛选，以确定感兴趣的精确区域。
4. 使用 FIB-SEM 收集数据，光束电流为 0.69 nA，加速电压为 2 kV。其他参数如下：停留时间 = 2 μs，体素大小 = 1.8 nm x 1.8 nm x 15 nm。

结果

图 1A 显示了使用传统化学双固定方法制备的视网膜感光器末梢的图像， 图 1B 显示了使用 OTO 方法制备的视网膜感光器末梢的图像。两者都通过 FIB-SEM 采样。可以清楚地看到，使用 OTO 方法可以尽可能地保留细胞膜结构，甚至可以清楚地看到囊泡的轮廓。此外，使用 OTO 方法获得的图像的对比度也更加清晰。

讨论

我们实施了 OTO 的 Volume EM 样品制备方案来分析视网膜组织中光感受器的末端结构。重点是详细介绍整个过程，从视网膜的分离和固定开始，到展示感光器轴突末端的 3D 重建结果。

与脑组织不同，视网膜组织的显着特征在于它没有区域差异。视网膜由三层神经元细胞体和两层突触连接组成，尽管其神经元和突触成分很复杂，但视网膜仍表现出规则和?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049