Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Resumen

Este protocolo describe los pasos detallados para la preparación de muestras de retina para microscopía electrónica de volumen, centrándose en las características estructurales de los terminales fotorreceptores de la retina.

Resumen

La microscopía electrónica de volumen (Volume EM) se ha convertido en una poderosa herramienta para visualizar la estructura 3D de células y tejidos con una precisión de nivel nanométrico. Dentro de la retina, varios tipos de neuronas establecen conexiones sinápticas en las capas plexiformes interna y externa. Si bien las técnicas convencionales de EM han proporcionado información valiosa sobre los orgánulos subcelulares de la retina, su limitación radica en proporcionar datos de imágenes en 2D, lo que puede dificultar mediciones precisas. Por ejemplo, cuantificar el tamaño de tres grupos de vesículas sinápticas distintas, cruciales para la transmisión sináptica, es un desafío en 2D. Volume EM ofrece una solución al proporcionar datos 3D a gran escala y de alta resolución. Vale la pena señalar que la preparación de la muestra es un paso crítico en el volumen EM, lo que afecta significativamente la claridad y el contraste de la imagen. En este contexto, esbozamos un protocolo de preparación de muestras para la reconstrucción en 3D de los terminales axónicos fotorreceptores en la retina. Este protocolo incluye tres pasos clave: disección y fijación de la retina, procesos de inclusión de muestras y selección del área de interés.

Introducción

La retina está densamente repleta de axones neuronales y dendritas entrelazados que forman sinapsis entre ellos¹. La microscopía es una herramienta indispensable para el estudio de la anatomía de la retina, ya que tiene estructuras finas, intrincadas y pequeñas. Aunque la microscopía electrónica (EM) proporciona una potencia sin precedentes para investigar la ultraestructura de los orgánulos subcelulares y la localización precisa de proteínas específicas a nivel nanométrico², produce imágenes limitadas al plano bidimensional (2D), lo que lleva a la pérdida potencial de información clave.....

Protocolo

Los protocolos de cuidado y uso de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Wenzhou y siguieron las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO). Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y se les suministró una dieta estándar de comida.

1. Disección y fijación de la retina

1. Anestesiar a los ratones (C57BL/6J, machos, 8 semanas de edad, 20-25 g) inyectando 2,2,2-tribromoetanol (0,25 mg/g de peso corporal) por vía intraperitoneal. Confirme la pro....

Discusión

Implementamos el protocolo de preparación de muestras Volume EM de OTO para analizar la estructura terminal de los fotorreceptores en el tejido de la retina. La atención se centró en detallar todo el procedimiento, desde el desprendimiento y la fijación de la retina hasta mostrar los resultados de la reconstrucción en 3D de los terminales de los axones fotorreceptores.

La característica distintiva del tejido de la retina, a diferencia del tejido cerebral.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049