Préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique

Résumé

Ce protocole décrit en détail les étapes de préparation des échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique, en mettant l’accent sur les caractéristiques structurelles des terminaisons des photorécepteurs rétiniens.

Résumé

La microscopie électronique volumique (Volume EM) est devenue un outil puissant pour visualiser la structure 3D des cellules et des tissus avec une précision nanométrique. À l’intérieur de la rétine, divers types de neurones établissent des connexions synaptiques dans les couches plexiformes internes et externes. Bien que les techniques EM conventionnelles aient permis d’obtenir des informations précieuses sur les organites subcellulaires de la rétine, leur limite réside dans la fourniture de données d’image 2D, ce qui peut entraver la précision des mesures. Par exemple, la quantification de la taille de trois bassins de vésicules synaptiques distincts, cruciale pour la transmission synaptique, est un défi en 2D. Volume EM offre une solution en fournissant des données 3D à grande échelle et à haute résolution. Il convient de noter que la préparation des échantillons est une étape critique du volume EM, car elle a un impact significatif sur la clarté et le contraste de l’image. Dans ce contexte, nous décrivons un protocole de préparation d’échantillons pour la reconstruction 3D des terminaisons axonales des photorécepteurs dans la rétine. Ce protocole comprend trois étapes clés : la dissection et la fixation de la rétine, les processus d’intégration de l’échantillon et la sélection de la zone d’intérêt.

Introduction

La rétine est densément remplie d’axones neuronaux et de dendrites entrelacés qui forment des synapses entre eux¹. La microscopie est un outil indispensable pour l’étude de l’anatomie de la rétine car elle possède des structures fines, complexes et petites. Bien que la microscopie électronique (EM) offre une puissance inégalée pour étudier l’ultrastructure des organites subcellulaires et la localisation précise de protéines spécifiques au niveau^{nanométrique 2}, elle produit des images limitées au plan bidimensionnel (2D), entraînant une perte potentielle d’informations clés.

Protocole

Les protocoles de soin et d’utilisation des animaux ont été approuvés par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Wenzhou et ont suivi les directives établies par l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO). Toutes les souris ont été maintenues dans un cycle de 12 heures de lumière et de 12 heures d’obscurité et ont reçu un régime alimentaire standard.

1. Dissection et fixation de la rétine

1. Anesthésier les souris (C57BL/6J, mâle, 8 semaines, 20-25 g) en injectant du 2,2,2-tribromoéthanol (0,25 mg/g de poids corporel) par voie intrapéritonéale. C....

Discussion

Nous avons mis en œuvre le protocole de préparation d’échantillons Volume EM de l’OTO pour analyser la structure terminale des photorécepteurs dans le tissu rétinien. L’accent a été mis sur les détails de l’ensemble de la procédure, en commençant par le décollement et la fixation de la rétine jusqu’à la présentation des résultats de la reconstruction 3D des terminaisons axonales des photorécepteurs.

La particularité du tissu rétinie.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049