הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים להכנת דגימות רשתית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים נפח, תוך התמקדות בתכונות המבניות של הדקי קולטני אור ברשתית.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים נפח (Volume EM) התגלה ככלי רב עוצמה להדמיית המבנה התלת-ממדי של תאים ורקמות בדיוק ברמה ננומטרית. בתוך הרשתית, סוגים שונים של נוירונים יוצרים קשרים סינפטיים בשכבות הפרספקס הפנימיות והחיצוניות. בעוד שטכניקות EM קונבנציונליות הניבו תובנות יקרות ערך לגבי אברונים תת-תאיים ברשתית, המגבלה שלהם טמונה באספקת נתוני תמונה דו-ממדיים, שיכולים לעכב מדידות מדויקות. לדוגמה, כימות גודלן של שלוש בריכות שלפוחית סינפטיות נפרדות, החיוניות להעברה סינפטית, הוא מאתגר בדו-ממד. Volume EM מציעה פתרון על ידי אספקת נתונים תלת-ממדיים בקנה מידה גדול וברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי הכנת הדגימה היא שלב קריטי בנפח EM, המשפיע באופן משמעותי על בהירות התמונה וניגודיות. בהקשר זה, אנו מתווים פרוטוקול הכנת דגימה לשחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור ברשתית. פרוטוקול זה כולל שלושה שלבים מרכזיים: דיסקציה וקיבוע רשתית, תהליכי הטמעת דגימה ובחירת תחום העניין.

Introduction

הרשתית עמוסה בצפיפות באקסונים עצביים ודנדריטים המשתלבים זה בזה ויוצרים סינפסות ביניהם¹. מיקרוסקופיה היא כלי חיוני לחקר אנטומיה של הרשתית מכיוון שיש לה מבנים עדינים, מורכבים וקטנים. למרות שמיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מספק כוח שאין שני לו לחקור את המבנה העל-תאי של אברונים תת-תאיים ואת הלוקליזציה המדויקת של חלבונים ספציפיים ברמה הננומטרית², הוא מייצר תמונות המוגבלות למישור הדו-ממדי (2D), מה שמוביל לאובדן פוטנציאלי של מידע מפתח.

הפיתוח של טכניקות מתפתחות של מיקרוסקופ אלקטרונים בנפח ברזולוציה גבוהה (Volume EM) תומך במתן מידע מבני תלת מימדי (3D) מקיף יותר בקנה מידה גדול יותר. כמה שיטות EM 3D נבדקו לאחרונה על ידי אחרים ^3,4,5. 3D EM מאפשר שחזור של צורה עצבית ופרטי קישוריות, ומאפשר ניתוח כמותי מדויק של מבנים מעניינים. זה מוכיח כי הנתונים המתקבלים על ידי נפח EM הם שיטתיים יותר, שלמים ומדויקים.

קולטני אור ברשתית, המהווים את הנוירונים הראשוניים באיתות חזותי ^6,7, מקימים סינפסות עם דנדריטים של תאים דו-קוטביים ואופקיים מסדר שני במסוף הפוטורצפטור כדי להקל על אותות מעוררים ^8,9. הדקים אלה, המכונים פדיקור חרוט ושרטוט מוטות, כוללים שלושה מרכיבים חיוניים: מיטוכונדריה, סרטים סינפטיים ובועיות סינפטיות. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בעיקר במבנה הכללי של סינפסות סרט, היה היעדר בולט של חקירה לגבי המבנה העדין של רכיבים עיקריים, כולל מיטוכונדריה, סרט, בריכות שלפוחית, והארגון המרחבי שלהם בטרמינלים 10,11,12,13. ניתוח מדויק ושיטתי של כל רכיב, יחד עם הבנה של הקשר ההדדי שלהם בתוך הדקי קולטני אור, חיוני לפענוח הארגון המרחבי ולתפיסה מקיפה של פונקציות עיבוד חזותי. בפוטורצפטורים, מיטוכונדריה נמצאים בעיקר במקטע הפנימי, בגוף התא ובטרמינל. התמקדנו כאן במיטוכונדריה בפוטורצפטורים הסופיים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM), סוג של נפח EM המתגאה ברזולוציה גבוהה (x, y ו- z ברזולוציה < 5 ננומטר) ושטף נפח גדול יחסית ^4,14, עומד ככלי רב עוצמה להדמיה מדויקת של המבנה התלת-ממדי של הדקי קולטני אור.

הן FIB-SEM והן Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) הם Volume EM המבוסס על SEM לקבלת תמונה של רקמות על ידי סריקת פני השטח של הדגימה. התכונות האולטרה-סטרוקטורליות של פני השטח של הדגימה מתגלות באמצעות הניגוד שנוצר על ידי עוצמת אלקטרונים משניים או מפוזרים לאחור (BSE) כאשר קרן האלקטרונים סורקת את הדגימה¹⁵. בעיקרו של דבר, זיהוי BSE או אלקטרונים משניים משטח החתך של דגימת רקמה משובצת שרף ב- SEM מאפשר קבלת תמונות של הדגימה המשובצת^16,17. כאשר BSE או אלקטרונים משניים נוצרים פחות, ניתן לקבל מידע על משטח הדגימה בלבד. השגת ניגודיות עקבית ותמונות טוריות באיכות גבוהה מחייבת שיקוע מספיק של מתכות כבדות בדגימה. לכן, פרוטוקולים ספציפיים להכנת דגימות חיוניים לסגמנטציה עוקבת, שחזור תלת-ממדי וניתוח בעת שימוש ב-SEM להדמיה סדרתית. שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) היא ערכת הכנת דגימות טיפוסית למיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממדי של דגימות ביולוגיות, תוך שמירה על מבנה הממברנות המכילות שומנים ושמירה על ניגודיות טובה^18,19.

כאן, פיתחנו את שיטת OTO להכנת דגימות רשתית לשימוש ב- Volume EM. תהליך זה מתמקד במיוחד בניתוח הרשתית, קביעת זמן הקיבוע האופטימלי לרקמת הרשתית ופירוט ההליכים ואמצעי הזהירות הספציפיים בהכנת דגימה תלת ממדית. בנוסף, סגמנטציה ושחזור תלת ממדי של מבנה היעד הם שלבים אינטגרליים ביישום מורחב זה. הרשתית, בהיותה מבנה קטן ומאתגר להשגת חומרים, דורשת פעולות מהירות ומדויקות עבור EM, עם זמנים קבועים וריאגנטים טריים מוכנים לשימוש מיידי.

Protocol

פרוטוקולים לטיפול ושימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו ועקבו אחר ההנחיות שנקבעו על ידי האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO). כל העכברים נשמרו במחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות וסופקו להם דיאטת צ'או סטנדרטית.

1. דיסקציה וקיבוע הרשתית

1. מרדימים את העכברים (C57BL/6J, זכר, בן 8 שבועות, 20-25 גרם) על ידי הזרקת 2,2,2-טריברומואתנול (0.25 מ"ג/גרם משקל גוף) תוך צפקית. יש לוודא את עומק ההרדמה ללא נסיגה של הכף האחורית לאחר צביטת הבוהן או ללא רפלקס מצמוץ. לאחר מכן, נקע את חוליית הצוואר בעודו תחת הרדמה כדי להרדים את החיה.
   הערה: Tribromoethanol נבחר בשל יעילותו המתועדת היטב בגרימת הרדמה מהירה ואמינה במודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד עבור הליכים קצרי טווח. בעוד הרדמה באיכות תרופתית עדיפה, tribromoethanol מציע יתרונות ספציפיים בפרוטוקולים מסוימים, מה שהופך אותו חלופה מתאימה כאשר מוכן כראוי מנוהל. כל אמצעי הזהירות ננקטו כדי להבטיח שימוש בטוח ויעיל בו. מחקר זה דבק בשיקולים אתיים על ידי הבטחת הכנה, ניהול וניטור נאותים כדי להפחית סיכונים פוטנציאליים הקשורים לשימוש בו.
2. הסר את העיניים עם מספריים מעוקלים ולטבול את העיניים בתמיסה מעורבת המכילה 2% גלוטראלדהיד ו -2% פרפורמלדהיד בחיץ פוספט (PB, 0.1 M, pH 7.4).
3. הסר את המקטע הקדמי ואת הזגוגית מהעיניים עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ המנתחת.
4. מקלפים את לובן העין עם שתי המלקחיים עד שהרשתית מבודדת לחלוטין מהעין.
5. חותכים את הרשתית במהירות לרצועות בעובי 100 - 200 מיקרומטר עם סכין גילוח ומטפלים ברצועות הרשתית עם פיפטת פסטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (EP) המכיל 2% גלוטראלדהיד ו-2% פרפורמלדהיד בחיץ פוספט (PB, 0.1 M, pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) על המסובב. לאחר השלמת, מקם את הצינורות כדי לתקן ב 4 ° C במשך 24 שעות.

2. תהליך הטמעה לדוגמה

1. לאחר שטיפה במאגר נתרן קודילט 0.1 M (pH 7.4) 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, לדגור על רצועות הרשתית עם תמיסה המכילה 1.5% אשלגן פרוציאניד ו 1% OsO₄ (ב PB, pH7.4) ב 0.1 M נתרן cacodylate עם 4 mM CaCl₂ במשך 1.5 שעות בחושך על קרח.
   הערה: דגירה כהה וחוסר פוספט יכולים למנוע משקעים וממצאים בדגימה.
2. שטפו את רצועות הרשתית 3 פעמים ב-ddH₂O במשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן טפלו עם 1% thiocarbohydrazide ב-ddH₂O במשך 30 דקות בחושך ב-RT.
3. לאחר שטיפה ב-ddH₂O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לדגור על רצועות הרשתית ב-2% OsO4 (ב-PB, PH 7.4) למשך 45 דקות בחושך ב-RT.
4. לאחר שטיפה ב ddH₂O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לטבול את רצועות הרשתית ב 1% אורניל אצטט מימי בחושך ב 4 ° C במשך הלילה.
5. למחרת, לאחר שטיפה ב-ddH₂O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לטפל ברצועות הרשתית עם 0.66% עופרת חנקתית בחומצה L-אספרטית (0.03 M, pH 5.5) למשך 40 דקות ב-65°C.
6. לאחר שטיפה ב-ddH₂O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לייבש את רצועות הרשתית עם ריכוז אתנול עולה של 30%, 50%, 70%, 90% ו-100% למשך 20 דקות בכל תמיסה.
7. יש לטפל ברצועות הרשתית בתמיסה מעורבת המכילה אתנול ואצטון שווים למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף אצטון פעמיים למשך 20 דקות כל אחת.
8. יש לחדור לרצועות הרשתית באצטון/שרף מעורבב ביחס של 7:3 בחושך ב-RT למשך הלילה ולאחר מכן אצטון/שרף ביחס של 3:7 בחושך למשך 24 שעות ב-RT.
   הערה: ההרכב המדויק של השרף הוא כדלקמן: Epon812 10.06 מ"ל, DDSA 4 מ"ל, MNA 5.94 מ"ל ו- DMP-30 0.2 מ"ל.
9. שנה את הצינורות למחרת ולחדור את רצועות הרשתית עם שרף טהור במשך 24 שעות ב 45 ° C. שנה את השרף שוב למחרת, והטמע את רצועות הרשתית במשך 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
   הערה: מטרת העלאת הטמפרטורה היא לשפר את החדירה.

3. בחירת תחום העניין

1. חתכו את גושי השרף למקטעים בעובי 1 מיקרומטר, הכתימו חלקים עם 1% טולוידין-כחול, והתבוננו במבנה הכללי של הרשתית תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את האזורים המחוספסים של העניין.
2. מצפים את גושי השרף בפלטינה באמצעות קוטר מרזב, ולאחר מכן כרסום בחתך בעובי 70 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יון ממוקדת תחת זרם של 0.23 nA ומתח תאוצה של 30 קילו וולט.
3. סנן מראש את המקטע באמצעות FIB-SEM עם הגדלה של 2000x כדי לזהות את אזורי העניין המדויקים.
4. אסוף את הנתונים באמצעות FIB-SEM עם זרם קרן של 0.69 nA ומתח תאוצה של 2 kV. הפרמטרים האחרים הם כדלקמן: זמן שהייה = 2 μs, גודל voxel = 1.8 nm x 1.8 nm x 15 nm.

תוצאות

איור 1A מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת הקיבוע הכימי הכפול המסורתית, ואיור 1B מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת OTO. שניהם נדגמו על ידי FIB-SEM. ניתן לראות בבירור כי מבנה קרום התא יכול להישמר ככל האפשר באמ...

Discussion

יישמנו את פרוטוקול הכנת דגימות Volume EM של OTO כדי לנתח את המבנה הסופי של הפוטורצפטורים ברקמת הרשתית. ההתמקדות הייתה בפירוט ההליך כולו, החל מהניתוק והקיבוע של הרשתית ועד להצגת התוצאות של שחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור.

התכונה הייחודית של רקמת הרשתית, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049