הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים להכנת דגימות רשתית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים נפח, תוך התמקדות בתכונות המבניות של הדקי קולטני אור ברשתית.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים נפח (Volume EM) התגלה ככלי רב עוצמה להדמיית המבנה התלת-ממדי של תאים ורקמות בדיוק ברמה ננומטרית. בתוך הרשתית, סוגים שונים של נוירונים יוצרים קשרים סינפטיים בשכבות הפרספקס הפנימיות והחיצוניות. בעוד שטכניקות EM קונבנציונליות הניבו תובנות יקרות ערך לגבי אברונים תת-תאיים ברשתית, המגבלה שלהם טמונה באספקת נתוני תמונה דו-ממדיים, שיכולים לעכב מדידות מדויקות. לדוגמה, כימות גודלן של שלוש בריכות שלפוחית סינפטיות נפרדות, החיוניות להעברה סינפטית, הוא מאתגר בדו-ממד. Volume EM מציעה פתרון על ידי אספקת נתונים תלת-ממדיים בקנה מידה גדול וברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי הכנת הדגימה היא שלב קריטי בנפח EM, המשפיע באופן משמעותי על בהירות התמונה וניגודיות. בהקשר זה, אנו מתווים פרוטוקול הכנת דגימה לשחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור ברשתית. פרוטוקול זה כולל שלושה שלבים מרכזיים: דיסקציה וקיבוע רשתית, תהליכי הטמעת דגימה ובחירת תחום העניין.

Introduction

הרשתית עמוסה בצפיפות באקסונים עצביים ודנדריטים המשתלבים זה בזה ויוצרים סינפסות ביניהם¹. מיקרוסקופיה היא כלי חיוני לחקר אנטומיה של הרשתית מכיוון שיש לה מבנים עדינים, מורכבים וקטנים. למרות שמיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מספק כוח שאין שני לו לחקור את המבנה העל-תאי של אברונים תת-תאיים ואת הלוקליזציה המדויקת של חלבונים ספציפיים ברמה הננומטרית², הוא מייצר תמונות המוגבלות למישור הדו-ממדי (2D), מה שמוביל לאובדן פוטנציאלי של מידע מפתח.

הפיתוח של טכניקות מתפתחות של מיקרוסקופ אלקטרונים בנפח ברזולוציה גבוהה (Volume EM) תומך במתן מידע מבני תלת מימדי (3D) מקיף יותר בקנה מידה גדו....

Protocol

פרוטוקולים לטיפול ושימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו ועקבו אחר ההנחיות שנקבעו על ידי האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO). כל העכברים נשמרו במחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות וסופקו להם דיאטת צ'או סטנדרטית.

1. דיסקציה וקיבוע הרשתית

1. מרדימים את העכברים (C57BL/6J, זכר, בן 8 שבועות, 20-25 גרם) על ידי הזרקת 2,2,2-טריברומואתנול (0.25 מ"ג/גרם משקל גוף) תוך צפקית. יש לוודא את עומק ההרדמה ללא נסיגה של הכף האחורית לאחר צביטת הבוהן או ללא רפלקס מצמוץ. לאחר מכן, נקע את חוליית הצוואר בעודו תחת הרדמה כדי להרדים את החיה.
   הערה: Tribromoethanol נבחר בשל י....

תוצאות

איור 1A מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת הקיבוע הכימי הכפול המסורתית, ואיור 1B מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת OTO. שניהם נדגמו על ידי FIB-SEM. ניתן לראות בבירור כי מבנה קרום התא יכול להישמר ככל האפשר באמ.......

Discussion

יישמנו את פרוטוקול הכנת דגימות Volume EM של OTO כדי לנתח את המבנה הסופי של הפוטורצפטורים ברקמת הרשתית. ההתמקדות הייתה בפירוט ההליך כולו, החל מהניתוק והקיבוע של הרשתית ועד להצגת התוצאות של שחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור.

התכונה הייחודית של רקמת הרשתית, .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049