Preparação de amostras de retina para microscopia eletrônica de volume

Resumo

Este protocolo descreve as etapas detalhadas para preparar amostras de retina para microscopia eletrônica de volume, com foco nas características estruturais dos terminais fotorreceptores da retina.

Resumo

A microscopia eletrônica de volume (Volume EM) surgiu como uma ferramenta poderosa para visualizar a estrutura 3D de células e tecidos com precisão em nível nanométrico. Dentro da retina, vários tipos de neurônios estabelecem conexões sinápticas nas camadas plexiformes interna e externa. Embora as técnicas convencionais de EM tenham produzido informações valiosas sobre as organelas subcelulares da retina, sua limitação está em fornecer dados de imagem 2D, o que pode dificultar medições precisas. Por exemplo, quantificar o tamanho de três pools de vesículas sinápticas distintas, cruciais para a transmissão sináptica, é um desafio em 2D. O Volume EM oferece uma solução fornecendo dados 3D em grande escala e alta resolução. Vale a pena notar que a preparação da amostra é uma etapa crítica no Volume EM, impactando significativamente a clareza e o contraste da imagem. Nesse contexto, delineamos um protocolo de preparação de amostras para a reconstrução 3D de terminais axônicos fotorreceptores na retina. Este protocolo inclui três etapas principais: dissecção e fixação da retina, processos de incorporação de amostras e seleção da área de interesse.

Introdução

A retina é densamente repleta de axônios neuronais entrelaçados e dendritos que formam sinapses entre eles¹. A microscopia é uma ferramenta indispensável para estudar a anatomia da retina, pois possui estruturas finas, intrincadas e pequenas. Embora a microscopia eletrônica (EM) forneça um poder incomparável para investigar a ultraestrutura de organelas subcelulares e a localização precisa de proteínas específicas no nível nanométrico², ela produz imagens limitadas ao plano bidimensional (2D), levando à perda potencial de informações importantes.

O desenvolvim....

Protocolo

Os protocolos de cuidados e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Todos os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão e fornecidos com uma dieta padrão de ração.

1. Dissecção e fixação da retina

1. Anestesiar os camundongos (C57BL / 6J, macho, 8 semanas de idade, 20-25 g) injetando 2,2,2-tribromoetanol (0,25 mg / g de peso corporal) por via intraperitoneal. Confirme a profundidade da anestesia sem ret....

Discussão

Implementamos o protocolo de preparação de amostras Volume EM da OTO para analisar a estrutura terminal dos fotorreceptores no tecido retiniano. O foco foi detalhar todo o procedimento, desde o descolamento e fixação da retina até a apresentação dos resultados da reconstrução 3D dos terminais axônicos fotorreceptores.

A característica distintiva do tecido retiniano, ao contrário do tecido cerebral, reside na falta de diferenças regionais. Composta.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049