Preparação de amostras de retina para microscopia eletrônica de volume

Resumo

Este protocolo descreve as etapas detalhadas para preparar amostras de retina para microscopia eletrônica de volume, com foco nas características estruturais dos terminais fotorreceptores da retina.

Resumo

A microscopia eletrônica de volume (Volume EM) surgiu como uma ferramenta poderosa para visualizar a estrutura 3D de células e tecidos com precisão em nível nanométrico. Dentro da retina, vários tipos de neurônios estabelecem conexões sinápticas nas camadas plexiformes interna e externa. Embora as técnicas convencionais de EM tenham produzido informações valiosas sobre as organelas subcelulares da retina, sua limitação está em fornecer dados de imagem 2D, o que pode dificultar medições precisas. Por exemplo, quantificar o tamanho de três pools de vesículas sinápticas distintas, cruciais para a transmissão sináptica, é um desafio em 2D. O Volume EM oferece uma solução fornecendo dados 3D em grande escala e alta resolução. Vale a pena notar que a preparação da amostra é uma etapa crítica no Volume EM, impactando significativamente a clareza e o contraste da imagem. Nesse contexto, delineamos um protocolo de preparação de amostras para a reconstrução 3D de terminais axônicos fotorreceptores na retina. Este protocolo inclui três etapas principais: dissecção e fixação da retina, processos de incorporação de amostras e seleção da área de interesse.

Introdução

A retina é densamente repleta de axônios neuronais entrelaçados e dendritos que formam sinapses entre eles¹. A microscopia é uma ferramenta indispensável para estudar a anatomia da retina, pois possui estruturas finas, intrincadas e pequenas. Embora a microscopia eletrônica (EM) forneça um poder incomparável para investigar a ultraestrutura de organelas subcelulares e a localização precisa de proteínas específicas no nível nanométrico², ela produz imagens limitadas ao plano bidimensional (2D), levando à perda potencial de informações importantes.

O desenvolvimento de técnicas emergentes de microscopia eletrônica de volume de alta resolução (Volume EM) suporta o fornecimento de informações estruturais tridimensionais (3D) mais abrangentes e em maior escala. Alguns métodos de EM 3D foram recentemente revisados por outros ^3,4,5. O 3D EM permite a reconstrução da forma neuronal e detalhes de conectividade, permitindo uma análise quantitativa precisa das estruturas de interesse. Isso demonstra que os dados obtidos pelo EM de volume são mais sistemáticos, completos e precisos.

Os fotorreceptores da retina, constituindo os neurônios iniciais na sinalização visual ^6,7, estabelecem sinapses com dendritos de células bipolares e horizontais de segunda ordem no terminal do fotorreceptor para facilitar os sinais excitatórios ^8,9. Esses terminais, chamados de pedículos de cone e esférulas de bastonetes, abrangem três componentes cruciais: mitocôndrias, fitas sinápticas e vesículas sinápticas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado predominantemente na estrutura geral das sinapses em fita, houve uma notável ausência de investigação sobre a estrutura fina dos principais componentes, incluindo mitocôndrias, fitas, pools de vesículas e sua organização espacial em terminais 10,11,12,13. Uma análise precisa e sistemática de cada componente, juntamente com uma compreensão de sua interassociação dentro dos terminais fotorreceptores, é vital para desvendar a organização espacial e compreender de forma abrangente as funções de processamento visual. Nos fotorreceptores, as mitocôndrias estão presentes principalmente no segmento interno, corpo celular e terminal. Nós nos concentramos aqui nas mitocôndrias nos fotorreceptores terminais. A microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM), um tipo de EM de volume com alta resolução (resolução x, y e z < 5 nm) e um fluxo de volume relativamente grande ^4,14, é uma ferramenta potente para visualizar com precisão a estrutura 3D dos terminais fotorreceptores.

Tanto o FIB-SEM quanto o Microscópio Eletrônico de Varredura de Face de Bloco Serial (SBF-SEM) são Volume EM baseado em SEM para obter a imagem de tecidos por varredura da superfície da amostra. As características ultraestruturais da superfície de um espécime são reveladas através do contraste criado pela intensidade dos elétrons secundários ou retroespalhados (BSE) quando o feixe de elétrons varre a amostra¹⁵. Essencialmente, a detecção de BSE ou elétrons secundários da superfície da seção transversal de uma amostra de tecido embebido em resina em MEV permite a obtenção de imagens da amostra incorporada^16,17. Quando a BSE ou os elétrons secundários são menos gerados, as informações sobre a superfície da amostra só podem ser obtidas. A obtenção de contraste consistente e imagens seriais de alta qualidade requer deposição suficiente de metais pesados na amostra. Portanto, protocolos específicos de preparação de amostras são cruciais para segmentação subsequente, reconstrução 3D e análise ao utilizar SEM para imagens seriadas. O método ósmio-tiocarbohidrazida-ósmio (OTO) é um esquema típico de preparo de amostras para microscopia eletrônica 3D de amostras biológicas, preservando a estrutura das membranas contendo lipídios e mantendo bom contraste^18,19.

Aqui, desenvolvemos o método OTO para a preparação de amostras de retina para o uso do Volume EM. Este processo se concentra particularmente na dissecação da retina, determinando o tempo ideal de fixação para o tecido da retina e detalhando os procedimentos e precauções específicos na preparação de amostras 3D. Além disso, a segmentação e a reconstrução 3D da estrutura alvo são etapas integrais nesta aplicação estendida. A retina, sendo uma estrutura pequena e desafiadora para a obtenção de materiais, requer operações rápidas e precisas para EM, com tempos fixos e reagentes frescos preparados para uso imediato.

Protocolo

Os protocolos de cuidados e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Todos os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão e fornecidos com uma dieta padrão de ração.

1. Dissecção e fixação da retina

1. Anestesiar os camundongos (C57BL / 6J, macho, 8 semanas de idade, 20-25 g) injetando 2,2,2-tribromoetanol (0,25 mg / g de peso corporal) por via intraperitoneal. Confirme a profundidade da anestesia sem retração da pata traseira após beliscar o dedo do pé ou sem reflexo de piscar. Em seguida, desloque a vértebra cervical ainda sob anestesia para sacrificar o animal.
   NOTA: O tribromoetanol foi escolhido por sua eficácia bem documentada na indução de anestesia rápida e confiável em modelos de pequenos animais, particularmente para procedimentos de curto prazo. Embora os anestésicos de grau farmacêutico sejam preferidos, o tribromoetanol oferece vantagens específicas em certos protocolos, tornando-o uma alternativa adequada quando preparado e administrado adequadamente. Todas as precauções foram tomadas para garantir seu uso seguro e eficaz. Este estudo segue as considerações éticas, garantindo preparação, administração e monitoramento adequados para mitigar os riscos potenciais associados ao seu uso.
2. Remova os olhos com uma tesoura curva e mergulhe os olhos em uma solução mista contendo 2% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4).
3. Remova o segmento anterior e vítreo dos olhos com uma pinça sob o microscópio de dissecação.
4. Descasque a esclera com as duas pinças até que a retina esteja completamente isolada da ocular.
5. Corte a retina rapidamente em tiras de 100 a 200 μm de espessura com uma navalha e manuseie as tiras de retina com uma pipeta Pasteur em um novo tubo de microcentrífuga (EP) contendo 2% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4) por 2 h à temperatura ambiente (RT) no rotador. Após a conclusão, coloque os tubos a fixar a 4 °C durante 24 h.

2. Processo de incorporação de amostras

1. Após lavar em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) 5 vezes por 15 min cada, incube as tiras de retina com uma solução contendo ferrocianeto de potássio a 1,5% e OsO₄ a 1% (em PB, pH 7,4) em cacodilato de sódio 0,1 M com CaCl 4 mM₂ por 1,5 h no escuro no gelo.
   NOTA: A incubação escura e a falta de fosfato podem evitar a precipitação e artefatos na amostra.
2. Lave as tiras de retina 3 vezes em ddH₂O por 10 min cada e, em seguida, trate com tiocarbohidrazida a 1% em ddH₂O por 30 min no escuro em RT.
3. Depois de enxaguar em ddH₂O 3 vezes por 15 min cada, incubar as tiras de retina em 2% OsO4 (em PB, PH 7,4) por 45 min no escuro em RT.
4. Depois de lavar em ddH₂O 3 vezes por 15 min cada, mergulhe as tiras de retina em acetato de uranilo aquoso a 1% no escuro a 4 ° C durante a noite.
5. No dia seguinte, após lavar em ddH₂O 3 vezes por 15 min cada, trate as tiras de retina com nitrato de chumbo a 0,66% em ácido L-aspártico (0,03 M, pH 5,5) por 40 min a 65 °C.
6. Após lavar em ddH₂O 3 vezes por 15 min cada, desidrate as tiras de retina com concentração ascendente de etanol de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% por 20 min em cada solução.
7. Trate as tiras de retina com uma solução mista contendo etanol e acetona iguais por 20 min, seguida de uma lavagem com acetona 2 vezes por 20 min cada.
8. Infiltre as tiras de retina em acetona/resina misturada na proporção de 7:3 no escuro em RT durante a noite e, em seguida, acetona/resina em 3:7 no escuro por 24 h em RT.
   NOTA: A composição precisa da resina é a seguinte: Epon812 10.06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5.94 mL e DMP-30 0.2 mL.
9. Troque os tubos no dia seguinte e infiltre as tiras de retina com resina pura por 24 h a 45 °C. Troque a resina novamente no dia seguinte e incorpore as tiras de retina por 48 h a 60 °C.
   NOTA: O objetivo de aumentar a temperatura é melhorar a penetração.

3. Seleção da área de interesse

1. Corte os blocos de resina em seções de 1 μm de espessura, core as seções com 1% de azul de toluidina, e observe a estrutura geral da retina sob microscopia de luz para selecionar as regiões ásperas de interesse.
2. Revestir os blocos de resina com platina usando um revestidor por pulverização catódica, seguido de fresagem com seção de 70 nm de espessura usando uma microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizado sob uma corrente de 0,23 nA e tensão de aceleração de 30 kV.
3. Faça uma pré-triagem da seção usando FIB-SEM com ampliação de 2000x para identificar as regiões de interesse precisas.
4. Colete os dados usando FIB-SEM com uma corrente de feixe de 0,69 nA e tensão de aceleração de 2 kV. Os outros parâmetros são os seguintes: tempo de permanência = 2 μs, tamanho do voxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Resultados

A Figura 1A mostra a imagem dos terminais fotorreceptores retinianos preparados usando o método tradicional de dupla fixação química, e a Figura 1B mostra a imagem dos terminais fotorreceptores retinianos preparados usando o método OTO. Ambos foram amostrados por FIB-SEM. Pode-se ver claramente que a estrutura da membrana celular pode ser retida o máximo possível usando o método OTO, e até mesmo o contorno das vesícula...

Discussão

Implementamos o protocolo de preparação de amostras Volume EM da OTO para analisar a estrutura terminal dos fotorreceptores no tecido retiniano. O foco foi detalhar todo o procedimento, desde o descolamento e fixação da retina até a apresentação dos resultados da reconstrução 3D dos terminais axônicos fotorreceptores.

A característica distintiva do tecido retiniano, ao contrário do tecido cerebral, reside na falta de diferenças regionais. Composta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049