Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Vorbereitung von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf den strukturellen Merkmalen retinaler Photorezeptorterminalien liegt.

Zusammenfassung

Die Volumenelektronenmikroskopie (Volume EM) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die 3D-Struktur von Zellen und Geweben mit Präzision im Nanometerbereich zu visualisieren. Innerhalb der Netzhaut bauen verschiedene Arten von Neuronen synaptische Verbindungen in den inneren und äußeren plexiformen Schichten auf. Während herkömmliche EM-Techniken wertvolle Einblicke in subzelluläre Organellen der Netzhaut geliefert haben, liegt ihre Einschränkung in der Bereitstellung von 2D-Bilddaten, die genaue Messungen behindern können. Zum Beispiel ist die Quantifizierung der Größe von drei verschiedenen synaptischen Vesikelpools, die für die synaptische Übertragung entscheidend sind, in 2D eine Herausforderung. Volume EM bietet eine Lösung, indem es großflächige, hochauflösende 3D-Daten bereitstellt. Es ist erwähnenswert, dass die Probenvorbereitung ein kritischer Schritt bei der Volumen-EM ist, der sich erheblich auf die Bildschärfe und den Kontrast auswirkt. In diesem Zusammenhang skizzieren wir ein Probenvorbereitungsprotokoll für die 3D-Rekonstruktion von Photorezeptor-Axonendigungen in der Netzhaut. Dieses Protokoll umfasst drei wichtige Schritte: Netzhautdissektion und -fixierung, Probeneinbettungsprozesse und Auswahl des interessierenden Bereichs.

Einleitung

Die Netzhaut ist dicht gepackt mit ineinander verschlungenen neuronalen Axonen und Dendriten, die Synapsen zwischen ihnen bilden¹. Die Mikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der Netzhautanatomie, da sie feine, komplizierte und kleine Strukturen aufweist. Obwohl die Elektronenmikroskopie (EM) eine beispiellose Leistung bietet, um die Ultrastruktur subzellulärer Organellen und die genaue Lokalisierung spezifischer Proteine auf Nanometerebene² zu untersuchen, erzeugt sie Bilder, die auf die zweidimensionale (2D) Ebene beschränkt sind, was zu einem potenziellen Ver....

Protokoll

Die Pflege- und Verwendungsprotokolle der Tiere wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wenzhou genehmigt und folgten den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Alle Mäuse wurden in einem 12-stündigen Licht- und 12-stündigen Dunkelzyklus gehalten und mit einer Standard-Chow-Diät versorgt.

1. Netzhautdissektion und -fixation

1. Die Mäuse (C57BL/6J, männlich, 8 Wochen alt, 20-25 g) werden durch intraperitoneale Injektion von 2,2,2-Tribromethanol (0,25 mg/g Körpergewicht) anästhesiert. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch kein ....

Diskussion

Wir implementierten das OTO-Protokoll zur Probenvorbereitung Volume EM, um die terminale Struktur der Photorezeptoren im Netzhautgewebe zu analysieren. Der Schwerpunkt lag auf der Detaillierung des gesamten Verfahrens, beginnend mit der Ablösung und Fixierung der Netzhaut bis hin zur Präsentation der Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion der Photorezeptor-Axonendigungen.

Die Besonderheit des Netzhautgewebes liegt im Gegensatz zum Hirngewebe darin, dass es keine r.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049