عزل وثقافة الخلايا الظهارية الثديية البشرية الأولية

Summary

تشير الدراسة الحالية إلى بروتوكول أسهل وموفر للوقت واقتصادي لعزل وتنمية الخلايا الظهارية الثديية البشرية الأولية (HMECs) بكفاءة من كميات صغيرة من الأنسجة الثديية. هذا البروتوكول مناسب لإنتاج HMECs الأولية بسرعة لكل من التطبيقات المختبرية والسريرية.

Abstract

الغدة الثديية هي بنية أساسية للثدي وتلعب دورا أساسيا في التكاثر. حظيت الخلايا الظهارية الثديية البشرية (HMECs) ، وهي الخلايا الأصلية لسرطان الثدي والأمراض الالتهابية الأخرى المرتبطة بالثدي ، باهتمام كبير. ومع ذلك ، فإن عزل وزراعة HMECs الأولية في المختبر لأغراض البحث كان يمثل تحديا بسبب طبيعتها المتباينة للغاية والكيراتينية وعمرها القصير. لذلك ، فإن تطوير طريقة بسيطة وفعالة لعزل وزراعة HMECs له قيمة علمية كبيرة لدراسة بيولوجيا الثدي والأمراض المرتبطة بالثدي. في هذه الدراسة ، نجحنا في عزل HMECs الأولية من كميات صغيرة من الأنسجة الثديية عن طريق الهضم بمزيج من الإنزيمات جنبا إلى جنب مع مزرعة أولية في 5٪ مصل بقري جنيني - DMEM يحتوي على مثبط كيناز مرتبط ب Rho (ROCK) Y-27632 ، متبوعا بتوسع الثقافة في وسط الخلايا الكيراتينية الخالية من المصل. يعزز هذا النهج بشكل انتقائي نمو الخلايا الظهارية ، مما يؤدي إلى إنتاجية خلية محسنة. إن بساطة وراحة هذه الطريقة تجعلها مناسبة لكل من الأبحاث المختبرية والسريرية ، والتي يجب أن توفر رؤى قيمة في مجالات الدراسة المهمة هذه.

Introduction

سرطان الثدي هو النوع الرئيسي من السرطان الذي يتم تشخيصه لدى النساء على مستوى العالم وهو السبب الرئيسي للوفاة من السرطان¹. التسبب في سرطان الثدي معقد ، وينطوي على عوامل متعددة مثل الوراثة والبيئة ونمط الحياة. HMECs ، الخلايا النشطة المنتجة للحليب ، هي واحدة من أهم مكونات الأنسجة الثديية ومن المحتمل أن تكون الخلايا الأصلية المشاركة في سرطان الثدي. لذلك ، تلقت HMECs أكبر قدر من الاهتمام من الباحثين لدراسة سرطان الثدي². علاوة على ذلك ، تتمتع الخلايا الأولية بالقدرة على توفير توصيف ذي صلة بيولوجيا للعمليات الخلوية المعقدة بسبب احتفاظها بالاستقرار الجيني ، والتشكل الطبيعي ، ومجموعة أكثر اكتمالا من الوظائف الخلوية الأساسية التي لا يمكن تحقيقها باستخدام خطوط الخلايا الخالدة³. ومن ثم ، فإن عزل وثقافة HMECs الأولية هي خطوة أساسية لدراسة معظم الأمراض المرتبطة بالثدي مثل سرطان الثدي وأمراض التهاب الثدي.

في الوقت الحاضر ، تم إنشاء نظام مستقر وقابل للتكرار لعزل وثقافة وتحديد الخلايا الظهارية الثديية من الفئران والأبقار والخنازير والماعز^4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن عزلة وثقافة HMECs الأولية تمثل تحديا بسبب البيئة المكروية المعقدة وانخفاض إنتاجية الخلايا. على مدى عقود ، كان العلماء يبحثون عن الطريقة الأكثر فعالية لعزل وزراعة HMECs على الرغم من إنشاء نظام استزراع ل HMECs منذ ما يقرب من 20 عاما. على سبيل المثال ، طور Hammond et al. وسط استزراع خال من المصل نمت فيه HMECs بكفاءة⁸. في الآونة الأخيرة ، اختبر Zubeldia-Plazaola et al. أربع طرق عزل مختلفة باستخدام إجراءات هضم الإنزيم السريعة / البطيئة جنبا إلى جنب مع الترشيح المتسلسل أو خطوات الطرد المركزي التفاضلي للحصول على HMECs⁹. ووجدوا أن طريقة الهضم البطيء مع الطرد المركزي التفاضلي هي الطريقة الأكثر فعالية لعزل HMECs عن أنسجة الثدي الطازجة. ومع ذلك ، تتطلب طريقة العزل هذه قطعا كبيرة من الأنسجة (40-75 جم) وتستخدم كميات أكبر من إنزيمات الهضم. إجراءاتهم معقدة (على الأقل ثلاثة أجهزة طرد مركزي مختلفة للحصول على كسور خلايا مختلفة) ، فضلا عن أنها تستغرق وقتا طويلا. لذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى طريقة بسيطة وسريعة للحصول بكفاءة على مجموعات HMECs من كميات صغيرة من الأنسجة الثديية للبحث والتطبيقات السريرية⁹.

أظهرت دراساتنا السابقة أن إضافة مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCK) Y-27632 إلى وسط الاستزراع الأولي يمكن أن يبسط عملية عزل خلايا البشرة الجلدية البشرية¹⁰ ، والتي تم استخدامها أيضا بنجاح لعزل الخلايا الظهارية اللثوية¹¹. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت الأبحاث السابقة التي أجرتها مجموعة Zubeldia-Plazaola ومجموعة جين إلى أن Y-27632 لديه القدرة على تحفيز النمو السريع وغير المحدود في المختبر للخلايا الظهارية الأولية المشتقة من الأنسجة الثديية ^9,12. تهدف الدراسة الحالية إلى اختبار ما إذا كان استخدام Y-27632 من شأنه تبسيط عزل وثقافة HMECs ونجحنا في إنشاء طريقة بسيطة وسهلة التنفيذ لعزل HMECs من قطع صغيرة (1 جم) من أنسجة الثدي.

Protocol

يتم جمع الأنسجة الثديية الطبيعية الطازجة المستخدمة في هذا البروتوكول من الجراحة حول آفة التهاب الضرع الفصيصي الحبيبي المقاوم للحرارة في أول مستشفى تابع لجامعة تشجيانغ الطبية الصينية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات الطبية في أول مستشفى تابع لجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (البروتوكول رقم. ChiMCTR2100005281 ، التاريخ: 2017-07-17).

1. اقتناء الأنسجة

1. جمع الأنسجة الثديية الطازجة من العينات الجراحية المأخوذة من النساء البالغات في أنابيب معقمة تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 3٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S).
   ملاحظة: يجب التعامل مع الأنسجة الثديية وفقا للتفاصيل التالية في غضون 24 ساعة بعد جمعها من الجراحة.

2. المعالجة المسبقة للأنسجة

1. قم بإزالة الأنسجة الدهنية من الأنسجة الثديية باستخدام زوجين من الملقط ، مع التأكد من أن الأنسجة الثديية المتبقية ~ 1 غرام في الوزن.
2. اشطف الأنسجة الثديية في محلول إيثانول 75٪ (5 مل) لمدة 5 ثوان ثم اغسلها ب 20 مل من محلول الغسيل (الجدول 1) لمدة 2 × 5 دقائق.

3. هضم الأنسجة

1. قم بتقطيع الأنسجة الثديية إلى أجزاء أصغر ، وقم بتمزيق الأنسجة باستخدام شفرتين جراحيتين لمدة 15 دقيقة للحصول على تجانس الأنسجة. نقل قطع الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل.
2. أضف 10 مل من 5.0 مجم / مل ديسباز + 5.0 مجم / مل محلول كولاجيناز ، و 3 مل من 0.25٪ تربسين ، و 7 مل من PBS إلى إجمالي 20 مل من محلول الهضم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على شظايا الأنسجة الثديية. ضع الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية واحتضانه لمدة 1.5 ساعة ؛ هز الأنبوب كل 20 دقيقة.
3. أوقف عملية الهضم عن طريق حقن 20 مل من محلول التحييد. امزج المحتويات عن طريق سحب ~ 15x.
4. قم بتصفية الخليط من خلال مرشح شبكي 100 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي في 156 × غرام لمدة 5 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية وكرر حضانة الحبيبات ب 20 مل من محلول التحييد. امزج المحتويات عن طريق سحب 15x وأجهزة الطرد المركزي عند 156 × جم لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 مل من وسط الاستزراع الأولي. لوحة تعليق الخلية في طبق ثقافة الخلية 100 ملم.
7. زراعة الخلايا في حاضنة CO₂ 5٪ عند 37 درجة مئوية. استبدل وسط الاستزراع الأصلي بوسط خلية ظهارية جديد كل يوم ثالث. تحقق من الخلايا وتحديث الوسيط كل 2 أيام.

4. تمرير الخلية

1. قم بإزالة الطبق مقاس 100 مم من الحاضنة عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، وتجاهل الوسط المستخدم ، وشطف الطبق 2x مع 2 مل من PBS. قم بإزالة برنامج تلفزيوني ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين في كل طبق 100 مم.
   ملاحظة: قم بتدوير الطبق للتأكد من أن محلول التربسين ملامس بشكل كاف لقاع الطبق.
2. ضع طبق 100 مم في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ~ 7 دقائق لعملية الهضم.
3. افحص الخلايا باستخدام المجهر باستخدام هدف 40x للتأكد من أن معظم الخلايا قد تم فصلها عن قاع الطبق.
4. أوقف عملية الهضم بإضافة 8 مل من محلول معادلة ونقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل. امزج الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10-15x. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 156 × غرام لمدة 5 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الخلايا ب 10 مل من وسط الخلية الظهارية ، واحسب عدد الخلايا.
6. أضف 1 × 10⁶ خلايا في 10 مل من وسط الخلية الظهارية في طبق 100 مم.
7. تحديث وسط الخلية الظهارية ومراقبة الخلايا كل 2 أيام.

5. الحفظ بالتبريد للخلايا

1. كرر الخطوات 4.1-4.4.
2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول الحفظ بالتبريد للخلية.
3. نقل 1 مل من محلول الحفظ بالتبريد الذي يحتوي على الخلايا إلى كل قارورة مبردة.
4. سجل أسماء الخلايا المحفوظة بالتبريد وأرقام المقاطع والتواريخ.
5. ضع القوارير في حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه عند -80 درجة مئوية طوال الليل.
6. قم بإزالة القوارير المبردة من الفريزر -80 درجة مئوية وانقلها بسرعة إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

النتائج

يوضح الشكل 1 مخططا للإجراء. يتضمن البروتوكول استخدام مزيج من الإنزيمات ، وهي dispase و collagenase و trypsin. يستخدم هذا المزيج لغرض فصل الصفيحة الظهارية عن طبقة الخلايا الليفية تحتها ثم استخدام التربسين لفصل الخلايا الظهارية الثديية إلى معلق. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعزيز نمو الخلايا ال...

Discussion

تعتبر HMECs حيوية في الحفاظ على السلامة التشريحية والوظيفية للأنسجة الثديية وهي مفيدة في التحقيقات العلمية والتطبيقات السريرية والمجالات المرتبطة^{بها 15}. الخلايا الطلائية الأولية هي نوع من الخلايا المتخصصة التي لها ممرات محدودة وعمر أقصر. ومع ذلك ، فقد أعيقت نمو HMECs بسبب القيود ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor