Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Özet

Meme bezi, memenin temel bir yapısıdır ve üremede önemli bir rol oynar. Meme kanseri ve diğer meme ile ilgili enflamatuar hastalıkların köken hücreleri olan insan meme epitel hücreleri (HMEC'ler) büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin araştırma amacıyla in vitro olarak izole edilmesi ve kültürlenmesi, oldukça farklılaşmış, keratinize yapıları ve kısa ömürleri nedeniyle zor olmuştur. Bu nedenle, HMEC'leri izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmek, meme biyolojisi ve meme ile ilgili hastalıkların incelenmesi için büyük bilimsel değere sahiptir. Bu çalışmada, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren %5'lik fetal sığır serumu-DMEM'de bir başlangıç kültürü ile birleştirilmiş bir enzim karışımı ile sindirim yoluyla küçük miktarlarda meme dokusundan primer HMEC'leri başarılı bir şekilde izole ettik ve ardından serumsuz keratinosit ortamında kültür genişletmesi izledik. Bu yaklaşım, epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik ederek optimize edilmiş bir hücre verimi ile sonuçlanır. Bu yöntemin basitliği ve rahatlığı, onu hem laboratuvar hem de klinik araştırmalar için uygun hale getirir ve bu da bu önemli çalışma alanlarına değerli bilgiler sağlamalıdır.

Giriş

Meme kanseri, tüm dünyada kadınlarda teşhis edilen birincil kanser türüdür ve kanserden ölümlerin birincil nedenidir1. Meme kanserinin patogenezi karmaşıktır ve genetik, çevre ve yaşam tarzı gibi birçok faktörü içerir. Aktif süt üreten hücreler olan HMEC'ler, meme dokusunun en önemli bileşenlerinden biridir ve muhtemelen meme kanseri karsinogenezinde yer alan orijinal hücrelerdir. Bu nedenle, HMEC'ler meme kanseri çalışması için araştırmacılardan en fazla ilgiyi görmüştür2. Ayrıca, birincil hücreler, genetik stabiliteyi, normal morfolojiyi ve ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri ile elde edilemeyen daha eksiksiz bir temel hücresel işlevler setini korumaları nedeniyle karmaşık hücresel süreçlerin biyolojik olarak ilgili bir karakterizasyonunu sağlama yeteneğine sahiptir3. Bu nedenle, primer HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, meme kanseri ve meme inflamatuar hastalıkları gibi meme ile ilgili hastalıkların çoğunun incelenmesi için önemli bir adımdır.

Şu anda, sıçanlardan,, domuzlardan ve keçilerden meme epitel hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve tanımlanması için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem kurulmuştur 4,5,6,7. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, karmaşık mikro çevre ve düşük hücre verimi nedeniyle zordur. Onlarca yıldır bilim adamları, HMEC'ler için bir kültür sistemi yaklaşık 20 yıl önce kurulmuş olmasına rağmen, HMEC'leri izole etmek ve yetiştirmek için en etkili yöntemi arıyorlar. Örneğin, Hammond ve ark. HMEC'lerin verimli bir şekilde büyüdüğü serum içermeyen bir kültür ortamı geliştirdi8. Son zamanlarda, Zubeldia-Plazaola ve ark. HMEC'leri elde etmek için sıralı filtrasyon veya diferansiyel santrifüjleme adımları ile birlikte hızlı/yavaş enzim sindirim prosedürlerini kullanarak dört farklı izolasyon yöntemini test etti9. Diferansiyel santrifüjleme ile birlikte yavaş sindirim yönteminin, HMEC'leri taze meme dokusundan izole etmek için en etkili yöntem olduğunu buldular. Bununla birlikte, bu izolasyon yöntemi büyük doku parçaları (40-75 g) gerektirir ve daha büyük miktarlarda sindirim enzimleri kullanır. Prosedürleri karmaşıktır (farklı hücre fraksiyonları elde etmek için en az üç farklı santrifüjleme) ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, araştırma ve klinik uygulamalar için küçük miktarlarda meme dokusundan HMEC popülasyonlarını verimli bir şekilde elde etmek için hala basit ve hızlı bir yönteme ihtiyaç vardır9.

Önceki çalışmalarımız, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632'nin ilk kültür ortamına eklenmesinin, diş eti epitel hücrelerinin11 izolasyonu için de başarıyla kullanılan insan derisi epidermal hücrelerinin10 izole edilmesi sürecini basitleştirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, Zubeldia-Plazaola'nın grubu ve Jin'in grubu tarafından yürütülen daha önceki araştırmalar, Y-27632'nin meme dokusundantüretilen primer epitel hücrelerinin hızlı ve sınırsız in vitro büyümesini uyarma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir 9,12. Bu çalışma, Y-27632 kullanımının HMEC'lerin izolasyonunu ve kültürünü basitleştirip basitleştirmeyeceğini test etmeyi amaçladı ve HMEC'leri küçük meme dokusu parçalarından (1 g) izole etmek için basit ve kolay uygulanabilir bir yöntemi başarıyla oluşturduk.

Protokol

Bu protokolde kullanılan taze normal meme dokuları, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi'nin yönergelerine göre refrakter granülomatöz lobüler mastit lezyonu etrafındaki cerrahiden toplanır (Protokol No. ChiMCTR2100005281, Tarih: 2017-07-17).

1. Doku edinimi

  1. Yetişkin kadınlardan alınan cerrahi örneklerden taze meme dokularını% 3 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril tüplere toplayın.
    NOT: Meme dokuları, ameliyattan alındıktan sonraki 24 saat içinde aşağıdaki ayrıntılara göre ele alınmalıdır.

2. Dokunun ön tedavisi

  1. Yağ dokusunu meme dokusundan iki çift forseps ile çıkarın ve kalan meme dokusunun ~1 g ağırlığında olduğundan emin olun.
  2. Meme dokusunu 5 saniye boyunca% 75 etanol çözeltisinde (5 mL) durulayın ve ardından 20 mL yıkama çözeltisi (Tablo 1) ile 2 x 5 dakika yıkayın.

3. Dokunun sindirimi

  1. Meme dokusunu daha küçük parçalara bölün ve doku homojenatını elde etmek için 15 dakikalık bir süre boyunca iki cerrahi bıçak kullanarak dokuyu parçalayın. Doku parçalarını 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Meme dokusu parçalarını içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplam 20 mL sindirim solüsyonuna 10 mL 5.0 mg / mL dispas + 5.0 mg / mL kollajenaz solüsyonu, 3 mL %0.25 tripsin ve 7 mL PBS ekleyin. Tüpü 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin ve 1,5 saat inkübe edin; Tüpü her 20 dakikada bir çalkalayın.
  3. 20 mL nötralize edici solüsyon enjekte ederek sindirim işlemini durdurun. İçeriği ~15x pipetleyerek karıştırın.
  4. Karışımı 100 μm'lik bir gözenekli filtreden süzün. 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı çıkarın ve peletin inkübasyonunu 20 mL nötralize edici çözelti ile tekrarlayın. İçeriği 15x pipetleyerek karıştırın ve 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 10 mL başlangıç kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin.
  7. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde yetiştirin. Orijinal kültür ortamını her üç günde bir taze epitel hücre ortamı ile değiştirin. Hücreleri kontrol edin ve ortamı her 2 günde bir yenileyin.

4. Hücre geçişi

  1. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında 100 mm'lik kabı inkübatörden çıkarın, kullanılan ortamı atın ve kabı 2 mL PBS ile 2 kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve ardından her 100 mm'lik tabağa 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin.
    NOT: Tripsin çözeltisinin tabağın dibi ile yeterli temas ettiğinden emin olmak için tabağı döndürün.
  2. Sindirim işlemi için 100 mm'lik kabı 37 °C'lik bir inkübatöre ~7 dakika yerleştirin.
  3. Hücrelerin çoğunun tabağın dibinden ayrıldığından emin olmak için 40x objektif kullanarak hücreleri mikroskopla inceleyin.
  4. 8 mL nötralize edici solüsyon ekleyerek sindirim işlemini durdurun ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10-15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hücreleri 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı dikkatlice çıkarın, hücreleri 10 mL epitel hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını sayın.
  6. 100 mm'lik bir tabakta 10 mL epitel hücre ortamında 1 ×10 6 hücre ekleyin.
  7. Epitel hücre ortamını yenileyin ve hücreleri her 2 günde bir gözlemleyin.

5. Hücre kriyoprezervasyonu

  1. 4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın.
  2. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 2 mL hücre kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri içeren kriyoprezervasyon solüsyonunun 1 mL'sini her bir kriyojenik şişeye aktarın.
  4. Dondurularak saklanmış hücrelerin adlarını, geçiş numaralarını ve tarihlerini kaydedin.
  5. Şişeleri gece boyunca -80 ° C'de kontrollü bir dondurma kabına koyun.
  6. Kriyojenik şişeleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve uzun süreli saklama için hızlı bir şekilde sıvı nitrojene aktarın.

Sonuçlar

Şekil 1 , prosedürün bir şemasını göstermektedir. Protokol, dispas, kollajenaz ve tripsin gibi bir enzim kombinasyonunun kullanılmasını içerir. Bu kombinasyon, epitel tabakasını altındaki fibroblast tabakasından ayırmak ve daha sonra meme epitel hücrelerini bir süspansiyona ayırmak için tripsin kullanmak amacıyla kullanılır. Ek olarak, epitel hücrelerinin büyümesi, ilk kültür ortamına Y-27632 eklenerek etkili bir şekilde desteklendi. Sonuç olarak, bu yöntem, y...

Tartışmalar

HMEC'ler, meme dokusunun anatomik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında hayati öneme sahiptir ve bilimsel araştırmalarda, klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda faydalıdırlar15. Birincil epitel hücreleri, sınırlı geçişlere ve daha kısa ömürlere sahip bir tür özel hücredir. Bununla birlikte, HMEC'lerin büyümesi, meme kanseri ve meme ile ilgili diğer enflamatuar hastalıklardaki araştırma ilerlemelerini engelleyen teknik kısıtlamalar tarafından engellenmiştir

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin'in Zhejiang Eyaleti TCM Bilim ve Teknoloji Programından alınan hibelerle desteklenmiştir (2017ZA055; 2018ZA036) ve Çin'in Guizhou eyaleti, Zunyi Bilim ve Teknoloji Projesi (Zunyi Şehri Kehe Destek NS (2020) No. 18) X. Xu'ya. Yazarlar, hücre kültürü eğitimi verdiği için Youjia (Hangzhou) Biyomedikal Teknoloji Şirketi Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'na teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% TrypsinBasalmediaK431010For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge TubesNEST081722CK01For cell digestion
100 µm mesh filterSolarbio431752For HMECs filtration
100 mm Cell Culture DishCorning430167For cell culture
4% paraformaldehydesolarbioP1110-100mlFor immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge TubeCorning430829For cell centrifugation
Cell StrainerSolarbio431752Cell filtration
CentrifugeEppendorf5404HN133048Cell centrifuge
CO2 IncubatorThermo Scientific42820906For cell incubation
Collagenase Type IMerckSKU:SCR103For HMECs isolation
Dispase SolarbioCAS:42613-33-2For HMECs isolation
DMEMGibco8122622Component of neutralization medium
Fetal Bovine SerumGibco2556132PComponent of neutralization medium
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140-122Antibiotics
Phosphate buffered solutionTecono20201033Washing solution
rabbit anti CK7abcamab68459For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3abcamab199428For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632SolarbioIY0040ROCK inhibitor

Referanslar

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).
  2. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  3. Faridi, N., et al. Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors. Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).
  4. Tovar, E. A., et al. Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts. Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).
  5. Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. A "selective secondary tissue attachment" method for isolation and purification of mammary epithelial cells. Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).
  6. Bernardini, C., et al. Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project. Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).
  7. Zhang, D., et al. Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds. Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).
  8. Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).
  9. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784 (2018).
  11. Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632. J Vis Exp. (177), e62978 (2021).
  12. Jin, L., et al. Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture. Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).
  13. Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. Anatomy of the breast. Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).
  14. Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland. Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).
  15. Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).
  16. Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).
  17. Band, V., Sager, R. Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).
  18. Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. Some properties of cells cultured from early-lactation human milk. J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).
  19. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  20. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
  23. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).
  24. Ren, H. J., et al. Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase. Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Primer nsan Meme Epitel H creleriHMEC zolasyonuHMEC K lt rMeme BiyolojisiMeme KanseriMeme ile li kili Hastal klarRho li kili Kinaz ROCK nhibit rSerumsuz Keratinosit Besiyeri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır