Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu Makalede
Özet
Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.
Özet
Meme bezi, memenin temel bir yapısıdır ve üremede önemli bir rol oynar. Meme kanseri ve diğer meme ile ilgili enflamatuar hastalıkların köken hücreleri olan insan meme epitel hücreleri (HMEC'ler) büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin araştırma amacıyla in vitro olarak izole edilmesi ve kültürlenmesi, oldukça farklılaşmış, keratinize yapıları ve kısa ömürleri nedeniyle zor olmuştur. Bu nedenle, HMEC'leri izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmek, meme biyolojisi ve meme ile ilgili hastalıkların incelenmesi için büyük bilimsel değere sahiptir. Bu çalışmada, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren %5'lik fetal sığır serumu-DMEM'de bir başlangıç kültürü ile birleştirilmiş bir enzim karışımı ile sindirim yoluyla küçük miktarlarda meme dokusundan primer HMEC'leri başarılı bir şekilde izole ettik ve ardından serumsuz keratinosit ortamında kültür genişletmesi izledik. Bu yaklaşım, epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik ederek optimize edilmiş bir hücre verimi ile sonuçlanır. Bu yöntemin basitliği ve rahatlığı, onu hem laboratuvar hem de klinik araştırmalar için uygun hale getirir ve bu da bu önemli çalışma alanlarına değerli bilgiler sağlamalıdır.
Giriş
Meme kanseri, tüm dünyada kadınlarda teşhis edilen birincil kanser türüdür ve kanserden ölümlerin birincil nedenidir1. Meme kanserinin patogenezi karmaşıktır ve genetik, çevre ve yaşam tarzı gibi birçok faktörü içerir. Aktif süt üreten hücreler olan HMEC'ler, meme dokusunun en önemli bileşenlerinden biridir ve muhtemelen meme kanseri karsinogenezinde yer alan orijinal hücrelerdir. Bu nedenle, HMEC'ler meme kanseri çalışması için araştırmacılardan en fazla ilgiyi görmüştür2. Ayrıca, birincil hücreler, genetik stabiliteyi, normal morfolojiyi ve ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri ile elde edilemeyen daha eksiksiz bir temel h....
Protokol
Bu protokolde kullanılan taze normal meme dokuları, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi'nin yönergelerine göre refrakter granülomatöz lobüler mastit lezyonu etrafındaki cerrahiden toplanır (Protokol No. ChiMCTR2100005281, Tarih: 2017-07-17).
1. Doku edinimi
- Yetişkin kadınlardan alınan cerrahi örneklerden taze meme dokularını% 3 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril tüplere toplayın.
NOT: Meme dokuları, ameliyattan alındıktan sonraki 24 saat içinde aşağıdaki ayrıntıla....
Temsili Sonuçlar
Şekil 1 , prosedürün bir şemasını göstermektedir. Protokol, dispas, kollajenaz ve tripsin gibi bir enzim kombinasyonunun kullanılmasını içerir. Bu kombinasyon, epitel tabakasını altındaki fibroblast tabakasından ayırmak ve daha sonra meme epitel hücrelerini bir süspansiyona ayırmak için tripsin kullanmak amacıyla kullanılır. Ek olarak, epitel hücrelerinin büyümesi, ilk kültür ortamına Y-27632 eklenerek etkili bir şekilde desteklendi. Sonuç olarak, bu yöntem, y.......
Tartışmalar
HMEC'ler, meme dokusunun anatomik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında hayati öneme sahiptir ve bilimsel araştırmalarda, klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda faydalıdırlar15. Birincil epitel hücreleri, sınırlı geçişlere ve daha kısa ömürlere sahip bir tür özel hücredir. Bununla birlikte, HMEC'lerin büyümesi, meme kanseri ve meme ile ilgili diğer enflamatuar hastalıklardaki araştırma ilerlemelerini engelleyen teknik kısıtlamalar tarafından engellenmiştir
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin'in Zhejiang Eyaleti TCM Bilim ve Teknoloji Programından alınan hibelerle desteklenmiştir (2017ZA055; 2018ZA036) ve Çin'in Guizhou eyaleti, Zunyi Bilim ve Teknoloji Projesi (Zunyi Şehri Kehe Destek NS (2020) No. 18) X. Xu'ya. Yazarlar, hücre kültürü eğitimi verdiği için Youjia (Hangzhou) Biyomedikal Teknoloji Şirketi Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'na teşekkür eder.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Basalmedia | K431010 | For HMECs dissociation |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | NEST | 081722CK01 | For cell digestion |
| 100 µm mesh filter | Solarbio | 431752 | For HMECs filtration |
| 100 mm Cell Culture Dish | Corning | 430167 | For cell culture |
| 4% paraformaldehyde | solarbio | P1110-100ml | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | For cell centrifugation |
| Cell Strainer | Solarbio | 431752 | Cell filtration |
| Centrifuge | Eppendorf | 5404HN133048 | Cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 42820906 | For cell incubation |
| Collagenase Type I | Merck | SKU:SCR103 | For HMECs isolation |
| Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | For HMECs isolation |
| DMEM | Gibco | 8122622 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2556132P | Component of neutralization medium |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Phosphate buffered solution | Tecono | 20201033 | Washing solution |
| rabbit anti CK7 | abcam | ab68459 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| rabbit anti GATA3 | abcam | ab199428 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inhibitor |
Referanslar
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır