Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

Riepilogo

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Abstract

La ghiandola mammaria è una struttura fondamentale del seno e svolge un ruolo essenziale nella riproduzione. Le cellule epiteliali mammarie umane (HMEC), che sono le cellule originarie del cancro al seno e di altre malattie infiammatorie correlate al seno, hanno attirato una notevole attenzione. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di HMEC primari in vitro per scopi di ricerca è stato impegnativo a causa della loro natura altamente differenziata e cheratinizzazione e della loro breve durata. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficiente per isolare e coltivare gli HMEC è di grande valore scientifico per lo studio della biologia mammaria e delle malattie correlate al seno. In questo studio, siamo riusciti a isolare gli HMEC primari da piccole quantità di tessuto mammario mediante digestione con una miscela di enzimi combinata con una coltura iniziale in siero fetale bovino-DMEM al 5% contenente l'inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632, seguita da espansione della coltura in terreno cheratinocitario privo di siero. Questo approccio promuove selettivamente la crescita delle cellule epiteliali, con conseguente resa cellulare ottimizzata. La semplicità e la convenienza di questo metodo lo rendono adatto sia per la ricerca di laboratorio che per quella clinica, che dovrebbe fornire preziose informazioni su queste importanti aree di studio.

Introduzione

Il cancro al seno è il principale tipo di cancro diagnosticato nelle donne a livello globale ed è la principale causa di morte per cancro¹. La patogenesi del cancro al seno è complessa e coinvolge molteplici fattori come la genetica, l'ambiente e lo stile di vita. Le HMEC, cellule attive che producono latte, sono uno dei componenti più importanti del tessuto mammario e probabilmente sono le cellule originali coinvolte nella carcinogenesi del cancro al seno. Pertanto, gli HMEC hanno ricevuto la massima attenzione dai ricercatori per lo studio del cancro al seno². Inoltre, le cellule primarie hanno la capacità di fornire una caratterizzazione biologicamente rilevante di processi cellulari complessi grazie al loro mantenimento della stabilità genetica, della normale morfologia e di un insieme più completo di funzioni cellulari di base che non possono essere raggiunte con linee cellulari immortalizzate³. Pertanto, l'isolamento e la coltura degli HMEC primari è un passo essenziale per lo studio della maggior parte delle malattie legate al seno come il cancro al seno e le malattie infiammatorie al seno.

Attualmente, è stato stabilito un sistema stabile e riproducibile per l'isolamento, la coltura e l'identificazione di cellule epiteliali mammarie da ratti, mucche, suini e capre 4,5,6,7. Tuttavia, l'isolamento e la coltura degli HMEC primari sono difficili a causa del complesso microambiente e della bassa resa delle cellule. Per decenni, gli scienziati hanno cercato il metodo più efficace per isolare e coltivare gli HMEC, anche se un sistema di coltura per gli HMEC è stato istituito quasi 20 anni fa. Ad esempio, Hammond et al. hanno sviluppato un terreno di coltura privo di siero in cui gli HMEC sono cresciuti in modo efficiente⁸. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. hanno testato quattro diversi metodi di isolamento utilizzando procedure di digestione enzimatica veloce/lenta combinate con fasi di filtrazione sequenziale o centrifugazione differenziale per ottenere HMEC⁹. Hanno scoperto che il metodo della digestione lenta insieme alla centrifugazione differenziale è il metodo più efficiente per isolare gli HMEC dal tessuto mammario fresco. Tuttavia, questo metodo di isolamento richiede grandi pezzi di tessuto (40-75 g) e utilizza quantità maggiori di enzimi per la digestione. La loro procedura è complicata (almeno tre diverse centrifugazioni per ottenere diverse frazioni cellulari), oltre che dispendiosa in termini di tempo. Pertanto, è ancora necessario un metodo semplice e rapido per ottenere in modo efficiente popolazioni di HMEC da piccole quantità di tessuto mammario per la ricerca e le applicazioni cliniche⁹.

I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'aggiunta dell'inibitore della chinasi associata Rho (ROCK) Y-27632 nel terreno di coltura iniziale può semplificare il processo di isolamento delle cellule epidermiche della pelle umana¹⁰, che è stato utilizzato con successo anche per l'isolamento delle cellule epiteliali gengivali¹¹. Inoltre, ricerche precedenti condotte dal gruppo di Zubeldia-Plazaola e dal gruppo di Jin hanno indicato che Y-27632 ha la capacità di stimolare la crescita rapida e illimitata in vitro di cellule epiteliali primarie derivate dal tessuto mammario ^9,12. Il presente studio mirava a verificare se l'uso di Y-27632 avrebbe semplificato l'isolamento e la coltura degli HMEC e abbiamo stabilito con successo un metodo semplice e facilmente eseguibile per isolare gli HMEC da piccoli pezzi (1 g) di tessuto mammario.

Protocollo

I tessuti mammari freschi e normali utilizzati in questo protocollo vengono raccolti dalla chirurgia intorno alla lesione della mastite lobulare granulomatosa refrattaria nel primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang secondo le linee guida del Comitato etico medico del primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang (protocollo n. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).

1. Acquisizione di tessuti

1. Raccogliere tessuti mammari freschi da campioni chirurgici prelevati da donne adulte in provette sterili contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 3% di penicillina/streptomicina (P/S).
   NOTA: I tessuti mammari devono essere maneggiati secondo i seguenti dettagli entro 24 ore dal prelievo dall'intervento.

2. Pretrattamento dei tessuti

1. Rimuovere il tessuto adiposo dal tessuto mammario con due paia di pinze, assicurandosi che il tessuto mammario rimanente abbia un peso di ~1 g.
2. Sciacquare il tessuto mammario in una soluzione di etanolo al 75% (5 mL) per 5 s e quindi lavare con 20 mL di soluzione di lavaggio (Tabella 1) per 2 x 5 min.

3. Digestione dei tessuti

1. Tagliare il tessuto mammario in frammenti più piccoli, sminuzzando il tessuto utilizzando due lame chirurgiche per una durata di 15 minuti per ottenere l'omogeneizzato tissutale. Trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da centrifuga da 50 ml.
2. Aggiungere 10 mL di 5,0 mg/mL di dispasi + 5,0 mg/mL di soluzione di collagenasi, 3 mL di tripsina allo 0,25% e 7 mL di PBS per un totale di 20 mL di soluzione digestiva in una provetta da centrifuga da 50 mL che contiene i frammenti di tessuto mammario. Porre la provetta a bagnomaria a 37 °C e incubare per 1,5 h; Agitare il tubo ogni 20 minuti.
3. Arrestare il processo di digestione iniettando 20 ml di soluzione neutralizzante. Miscelare il contenuto pipettando ~15x.
4. Filtrare la miscela attraverso un filtro a maglie da 100 μm. Centrifugare a 156 × g per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante e ripetere l'incubazione del pellet con 20 mL di soluzione neutralizzante. Miscelare il contenuto pipettando 15 volte e centrifugare a 156 × g per 5 minuti.
6. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno di coltura iniziale. Piastra la sospensione cellulare in una piastra per coltura cellulare da 100 mm.
7. Coltivare le cellule in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura originale con un terreno di coltura epiteliale fresco ogni tre giorni. Controllare le celle e rinfrescare il terreno ogni 2 giorni.

4. Passaggio di celle

1. Rimuovere la piastra da 100 mm dall'incubatore quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, scartare il terreno utilizzato e sciacquare la piastra 2 volte con 2 mL di PBS. Rimuovere il PBS e quindi aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,05% in ogni piatto da 100 mm.
   NOTA: Agitare la pirofila per assicurarsi che la soluzione di tripsina sia a contatto sufficiente con il fondo della piastra.
2. Posizionare la piastra da 100 mm in un'incubatrice a 37 °C per ~7 minuti per il processo di digestione.
3. Esamina le cellule con un microscopio utilizzando un obiettivo 40x per assicurarti che la maggior parte delle cellule sia stata dissociata dal fondo del piatto.
4. Arrestare il processo di digestione aggiungendo 8 ml di soluzione neutralizzante e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Mescolare le cellule pipettando su e giù 10-15 volte. Centrifugare le celle a 156 × g per 5 min.
5. Rimuovere con cura il surnatante, risospendere le cellule con 10 ml di terreno cellulare epiteliale e contare il numero di cellule.
6. Aggiungere 1 × 10⁶ cellule in 10 mL di terreno cellulare epiteliale in un piatto da 100 mm.
7. Rinfrescare il terreno cellulare epiteliale e osservare le cellule ogni 2 giorni.

5. Crioconservazione cellulare

1. Ripetere i passaggi 4.1-4.4.
2. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di crioconservazione cellulare.
3. Trasferire 1 mL della soluzione di crioconservazione contenente le cellule in ciascuna fiala criogenica.
4. Annota i nomi delle celle crioconservate, i numeri di passaggio e le date.
5. Porre i flaconcini in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 °C per una notte.
6. Rimuovere le fiale criogeniche dal congelatore a -80 °C e trasferirle rapidamente in azoto liquido per una conservazione a lungo termine.

Risultati

Nella Figura 1 viene illustrato uno schema della procedura. Il protocollo prevede l'uso di una combinazione di enzimi, vale a dire dispasi, collagenasi e tripsina. Questa combinazione viene utilizzata allo scopo di staccare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante e successivamente utilizzare la tripsina per dissociare le cellule epiteliali mammarie in una sospensione. Inoltre, la crescita delle cellule epiteliali è stata efficacemente promossa aggiungendo Y-27632 al ter...

Discussione

Gli HMEC sono vitali per preservare l'integrità anatomica e funzionale del tessuto mammario e sono utili nelle indagini scientifiche, nelle implementazioni cliniche e nei domini associati¹⁵. Le cellule epiteliali primarie sono un tipo di cellule specializzate che hanno passaggi limitati e una durata di vita più breve. Tuttavia, la crescita degli HMEC è stata ostacolata da vincoli tecnici, che hanno di conseguenza ostacolato i progressi della ricerca sul cancro al seno e su altre malattie infiam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor