Isolement et culture de cellules épithéliales mammaires humaines primaires

Résumé

La présente étude fait état d’un protocole plus facile, rapide et économique permettant d’isoler et de cultiver efficacement des cellules épithéliales mammaires primaires (HMEC) humaines à partir de petites quantités de tissu mammaire. Ce protocole est adapté à la production rapide de HMEC primaires pour des applications de laboratoire et cliniques.

Résumé

La glande mammaire est une structure fondamentale du sein et joue un rôle essentiel dans la reproduction. Les cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC), qui sont à l’origine du cancer du sein et d’autres maladies inflammatoires liées au sein, ont suscité une attention considérable. Cependant, l’isolement et la culture d’HMEC primaires in vitro à des fins de recherche ont été difficiles en raison de leur nature kératinisée hautement différenciée et de leur courte durée de vie. Par conséquent, le développement d’une méthode simple et efficace pour isoler et cultiver les HMEC est d’une grande valeur scientifique pour l’étude de la biologie du sein et des maladies liées au sein. Dans cette étude, nous avons réussi à isoler les HMEC primaires à partir de petites quantités de tissu mammaire par digestion avec un mélange d’enzymes combiné à une culture initiale dans du sérum fœtal bovin à 5 % contenant l’inhibiteur de la kinase associée à la Rho (ROCK) Y-27632, suivie d’une expansion de la culture dans un milieu kératinocytaire sans sérum. Cette approche favorise sélectivement la croissance des cellules épithéliales, ce qui permet d’optimiser le rendement cellulaire. La simplicité et la commodité de cette méthode la rendent adaptée à la fois à la recherche en laboratoire et à la recherche clinique, ce qui devrait fournir des informations précieuses sur ces domaines d’étude importants.

Introduction

Le cancer du sein est le principal type de cancer diagnostiqué chez les femmes dans le monde et est la principale cause de décès par cancer¹. La pathogenèse du cancer du sein est complexe et implique de multiples facteurs tels que la génétique, l’environnement et le mode de vie. Les HMEC, cellules actives productrices de lait, sont l’un des composants les plus importants du tissu mammaire et sont probablement les cellules d’origine impliquées dans la cancérogenèse du cancer du sein. Par conséquent, les HMEC ont reçu le plus d’attention de la part des chercheurs pour l’étude du cancer du sein². De plus, les cellules primaires ont la capacité de fournir une caractérisation biologiquement pertinente de processus cellulaires complexes en raison de leur stabilité génétique, de leur morphologie normale et d’un ensemble plus complet de fonctions cellulaires de base qui ne peuvent pas être réalisées avec des lignées cellulaires immortalisées³. Par conséquent, l’isolement et la culture des HMEC primaires sont une étape essentielle pour l’étude de la plupart des maladies liées au sein telles que le cancer du sein et les maladies inflammatoires du sein.

À l’heure actuelle, un système stable et reproductible pour l’isolement, la culture et l’identification des cellules épithéliales mammaires de rats, de vaches, de porcs et de chèvres a été mis en place 4,5,6,7. Cependant, l’isolement et la culture des HMEC primaires sont difficiles en raison de la complexité du microenvironnement et du faible rendement des cellules. Pendant des décennies, les scientifiques ont cherché la méthode la plus efficace pour isoler et cultiver les HMEC, bien qu’un système de culture pour les HMEC ait été établi il y a près de 20 ans. Par exemple, Hammond et al. ont mis au point un milieu de culture sans sérum dans lequel les HMEC se sont développés efficacement⁸. Récemment, Zubeldia-Plazaola et al. ont testé quatre méthodes d’isolement différentes en utilisant des procédures de digestion enzymatique rapide/lente combinées à des étapes de filtration séquentielle ou de centrifugation différentielle pour obtenir des HMEC⁹. Ils ont constaté que la méthode de digestion lente associée à la centrifugation différentielle est la méthode la plus efficace pour isoler les HMEC du tissu mammaire frais. Cependant, cette méthode d’isolement nécessite de gros morceaux de tissu (40 à 75 g) et utilise de plus grandes quantités d’enzymes de digestion. Leur procédure est compliquée (au moins trois centrifugations différentes pour obtenir différentes fractions cellulaires), ainsi que chronophage. Par conséquent, une méthode simple et rapide est toujours nécessaire pour obtenir efficacement des populations de HMEC à partir de petites quantités de tissu mammaire pour la recherche et les applications cliniques⁹.

Nos études précédentes ont montré que l’ajout de l’inhibiteur de la kinase associée à la Rho (ROCK) Y-27632 dans le milieu de culture initial peut simplifier le processus d’isolement des cellules épidermiques de la peau humaine¹⁰, qui a également été utilisé avec succès pour l’isolement des cellules épithéliales gingivales¹¹. De plus, des recherches antérieures menées par le groupe de Zubeldia-Plazaola et le groupe de Jin ont indiqué que le Y-27632 a la capacité de stimuler la croissance in vitro rapide et illimitée des cellules épithéliales primaires dérivées du tissu mammaire ^9,12. La présente étude visait à vérifier si l’utilisation de l’Y-27632 simplifierait l’isolement et la culture des HMEC et nous avons réussi à établir une méthode simple et facile à réaliser pour isoler les HMEC à partir de petits morceaux (1 g) de tissu mammaire.

Protocole

Les tissus mammaires normaux frais utilisés dans ce protocole sont prélevés lors d’une intervention chirurgicale autour de la lésion de la mammite lobulaire granulomateuse réfractaire dans le premier hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise du Zhejiang, conformément aux directives du Comité d’éthique médicale du premier hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise du Zhejiang (protocole n° ChiMCTR2100005281, Date : 2017-07-17).

1. Acquisition de tissus

1. Prélever des tissus mammaires frais à partir d’échantillons chirurgicaux prélevés sur des femmes adultes dans des tubes stériles contenant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 3 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
   REMARQUE : Les tissus mammaires doivent être manipulés conformément aux détails suivants dans les 24 heures suivant le prélèvement de la chirurgie.

2. Prétraitement des tissus

1. Retirez le tissu adipeux du tissu mammaire à l’aide de deux paires de pinces, en veillant à ce que le tissu mammaire restant pèse ~1 g.
2. Rincer le tissu mammaire dans une solution d’éthanol à 75 % (5 ml) pendant 5 s, puis laver avec 20 ml de solution de lavage (tableau 1) pendant 2 x 5 min.

3. Digestion des tissus

1. Coupez le tissu mammaire en fragments plus petits, en déchiquetant le tissu à l’aide de deux lames chirurgicales pendant une durée de 15 min pour obtenir l’homogénat du tissu. Transférez les morceaux de tissu dans un tube à centrifuger de 50 ml.
2. Ajouter 10 mL de dispase à 5,0 mg/mL + 5,0 mg/mL de solution de collagénase, 3 mL de trypsine à 0,25 % et 7 mL de PBS à un total de 20 mL de solution de digestion dans un tube à centrifuger de 50 mL contenant les fragments de tissu mammaire. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 1,5 h ; Agitez le tube toutes les 20 min.
3. Arrêtez le processus de digestion en injectant 20 ml de la solution neutralisante. Mélangez le contenu en pipetant ~15x.
4. Filtrez le mélange à travers un filtre à mailles de 100 μm. Centrifuger à 156 × g pendant 5 min.
5. Retirer le surnageant et répéter l’incubation de la pastille avec 20 mL de solution neutralisante. Mélanger le contenu en pipetant 15x et centrifuger à 156 × g pendant 5 min.
6. Retirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension la pastille de cellule avec 10 mL de milieu de culture initial. Plaquez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm.
7. Cultivez les cellules dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C. Remplacer le milieu de culture d’origine par un milieu de cellules épithéliales frais tous les trois jours. Vérifiez les cellules et actualisez le milieu tous les 2 jours.

4. Passage cellulaire

1. Retirez la boîte de 100 mm de l’incubateur lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, jetez le milieu utilisé et rincez la boîte 2 fois avec 2 ml de PBS. Retirer le PBS, puis ajouter 2 ml de trypsine à 0,05 % dans chaque boîte de 100 mm.
   REMARQUE : Agitez le plat pour vous assurer que la solution de trypsine a un contact suffisant avec le fond du bol.
2. Placez la parabole de 100 mm dans un incubateur à 37 °C pendant ~7 min pour le processus de digestion.
3. Examinez les cellules au microscope à l’aide d’un objectif 40x pour vous assurer que la plupart des cellules ont été dissociées du fond de la boîte.
4. Arrêtez le processus de digestion en ajoutant 8 ml de solution neutralisante et transférez les cellules dans un tube de 15 ml. Mélangez les cellules en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois. Centrifuger les cellules à 156 × g pendant 5 min.
5. Retirez le surnageant avec précaution, remettez les cellules en suspension avec 10 ml de milieu cellulaire épithélial et comptez le nombre de cellules.
6. Ajouter 1 × 10⁶ cellules dans 10 mL de milieu cellulaire épithélial dans une boîte de 100 mm.
7. Rafraîchissez le milieu cellulaire épithélial et observez les cellules tous les 2 jours.

5. Cryoconservation cellulaire

1. Répétez les étapes 4.1 à 4.4.
2. Retirez le surnageant avec précaution et remettez les cellules en suspension dans 2 mL de solution de cryoconservation cellulaire.
3. Transférez 1 mL de la solution de cryoconservation contenant les cellules dans chaque flacon cryogénique.
4. Notez les noms des cellules cryoconservées, les numéros de passage et les dates.
5. Placez les flacons dans un récipient de congélation à débit contrôlé à -80 °C pendant la nuit.
6. Retirez les flacons cryogéniques du congélateur à -80 °C et transférez-les rapidement dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Résultats

La figure 1 montre un schéma de la procédure. Le protocole implique l’utilisation d’une combinaison d’enzymes, à savoir la dispase, la collagénase et la trypsine. Cette combinaison est utilisée dans le but de détacher la feuille épithéliale de la couche de fibroblastes située en dessous, puis d’utiliser la trypsine pour dissocier les cellules épithéliales mammaires en une suspension. De plus, la croissance des cellules épithéliales a été efficacement favorisée par l?...

Discussion

Les HMEC sont essentiels à la préservation de l’intégrité anatomique et fonctionnelle du tissu mammaire et sont utiles dans les recherches scientifiques, les mises en œuvre cliniques et les domaines associés¹⁵. Les cellules épithéliales primaires sont un type de cellules spécialisées qui ont des passages limités et une durée de vie plus courte. Cependant, la croissance des HMEC a été entravée par des contraintes techniques, qui ont par conséquent entravé les progrès de la reche...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor