Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

Zusammenfassung

Die Brustdrüse ist eine grundlegende Struktur der Brust und spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortpflanzung. Menschliche Brustepithelzellen (HMECs), die Ursprungszellen von Brustkrebs und anderen entzündlichen Erkrankungen der Brust, haben große Aufmerksamkeit erregt. Die Isolierung und Kultivierung von primären HMECs in vitro zu Forschungszwecken war jedoch aufgrund ihrer hochdifferenzierten, keratinisierten Natur und ihrer kurzen Lebensdauer eine Herausforderung. Daher ist die Entwicklung einer einfachen und effizienten Methode zur Isolierung und Kultivierung von HMECs von großem wissenschaftlichem Wert für die Erforschung der Brustbiologie und brustbedingter Krankheiten. In dieser Studie isolierten wir erfolgreich primäre HMECs aus kleinen Mengen von Brustgewebe durch Verdauung mit einer Mischung von Enzymen in Kombination mit einer Anfangskultur in 5% fötalem Rinderserum-DMEM, das den Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 enthielt, gefolgt von einer Kulturexpansion in serumfreiem Keratinozytenmedium. Dieser Ansatz fördert selektiv das Wachstum von Epithelzellen, was zu einer optimierten Zellausbeute führt. Die Einfachheit und Bequemlichkeit dieser Methode machen sie sowohl für die Labor- als auch für die klinische Forschung geeignet, was wertvolle Einblicke in diese wichtigen Studienbereiche liefern sollte.

Einleitung

Brustkrebs ist die häufigste Krebsart, die bei Frauen weltweit diagnostiziert wird, und die häufigste Todesursache durch Krebs¹. Die Pathogenese von Brustkrebs ist komplex und umfasst mehrere Faktoren wie Genetik, Umwelt und Lebensstil. HMECs, aktive milchproduzierende Zellen, sind einer der wichtigsten Bestandteile des Brustgewebes und wahrscheinlich die ursprünglichen Zellen, die an der Krebsentstehung von Brustkrebs beteiligt sind. Daher haben HMECs von Forschern die meiste Aufmerksamkeit für die Erforschung von Brustkrebs^{erhalten 2}. Darüber hinaus haben Primärzellen die Fähigkeit, eine biologisch relevante Charakterisierung komplexer zellulärer Prozesse zu liefern, da sie ihre genetische Stabilität, ihre normale Morphologie und einen vollständigeren Satz grundlegender zellulärer Funktionen beibehalten, die mit immortalisierten Zelllinien nicht erreicht werden können³. Daher ist die Isolierung und Kultur von primären HMECs ein wesentlicher Schritt für die Erforschung der meisten Brusterkrankungen wie Brustkrebs und entzündliche Brusterkrankungen.

Gegenwärtig wurde ein stabiles und reproduzierbares System für die Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von Brustepithelzellen von Ratten, Kühen, Schweinen und Ziegen etabliert 4,5,6,7. Die Isolierung und Kultivierung von primären HMECs stellt jedoch aufgrund der komplexen Mikroumgebung und der geringen Ausbeute der Zellen eine Herausforderung dar. Seit Jahrzehnten suchen Wissenschaftler nach der effektivsten Methode, um HMECs zu isolieren und zu kultivieren, obwohl bereits vor fast 20 Jahren ein Kultursystem für HMECs etabliert wurde. Zum Beispiel entwickelten Hammond et al. ein serumfreies Kulturmedium, in dem HMECs effizient wuchsen⁸. Kürzlich testeten Zubeldia-Plazaola et al. vier verschiedene Isolationsmethoden mit schnellen/langsamen Enzymaufschlussverfahren in Kombination mit sequentieller Filtration oder differentiellen Zentrifugationsschritten, um HMECs^{zu erhalten 9}. Sie fanden heraus, dass die Methode der langsamen Verdauung zusammen mit der differentiellen Zentrifugation die effizienteste Methode ist, um HMECs aus frischem Brustgewebe zu isolieren. Diese Isolierungsmethode erfordert jedoch große Gewebestücke (40-75 g) und verwendet größere Mengen an Verdauungsenzymen. Ihr Verfahren ist kompliziert (mindestens drei verschiedene Zentrifugen, um unterschiedliche Zellfraktionen zu erhalten) und zeitaufwändig. Daher ist nach wie vor eine einfache und schnelle Methode erforderlich, um Populationen von HMECs aus kleinen Mengen von Brustgewebe für Forschung und klinische Anwendungen effizient zu gewinnen⁹.

Unsere früheren Studien zeigten, dass die Zugabe des Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitors Y-27632 zum ursprünglichen Kulturmedium den Prozess der Isolierung menschlicher Hautepidermiszellen vereinfachen kann¹⁰, der auch erfolgreich für die Isolierung von gingivalen Epithelzellen eingesetzt wurde¹¹. Darüber hinaus haben frühere Forschungen, die von der Gruppe von Zubeldia-Plazaola und Jin durchgeführt wurden, gezeigt, dass Y-27632 die Fähigkeit hat, ein schnelles und unbegrenztes In-vitro-Wachstum von primären Epithelzellen aus Brustgewebe zu stimulieren ^9,12. In der vorliegenden Studie sollte getestet werden, ob die Verwendung von Y-27632 die Isolierung und Kultivierung von HMECs vereinfachen würde, und wir haben erfolgreich eine einfache und leicht durchzuführende Methode zur Isolierung von HMECs aus kleinen Stücken (1 g) Brustgewebe etabliert.

Protokoll

Frisches normales Brustgewebe, das in diesem Protokoll verwendet wird, wird aus der Operation um die Läsion der refraktären granulomatösen lobulären Mastitis im ersten angeschlossenen Krankenhaus der Zhejiang Chinese Medical University gemäß den Richtlinien des medizinischen Ethikkomitees des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Zhejiang Chinese Medical University (Protokoll Nr. ChiMCTR2100005281, Datum: 17.07.2017).

1. Entnahme von Gewebe

1. Sammeln Sie frisches Brustgewebe aus chirurgischen Proben, die von erwachsenen Frauen entnommen wurden, in sterile Röhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 3 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
   HINWEIS: Brustgewebe sollte innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme aus der Operation gemäß den folgenden Angaben behandelt werden.

2. Vorbehandlung des Gewebes

1. Entfernen Sie das Fettgewebe mit zwei Pinzettenpaaren aus dem Brustgewebe und stellen Sie sicher, dass das verbleibende Brustgewebe ~1 g wiegt.
2. Spülen Sie das Brustgewebe 5 s lang in einer 75%igen Ethanollösung (5 mL) und waschen Sie es dann 2 x 5 Minuten lang mit 20 mL Waschlösung (Tabelle 1).

3. Verdauung des Gewebes

1. Schneiden Sie das Brustgewebe in kleinere Fragmente und zerkleinern Sie das Gewebe mit zwei chirurgischen Klingen für eine Dauer von 15 Minuten, um das Gewebehomogenat zu erhalten. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 10 ml 5,0 mg/ml Dispase + 5,0 mg/ml Kollagenaselösung, 3 ml 0,25% Trypsin und 7 ml PBS zu insgesamt 20 ml Aufschlusslösung in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, das die Brustgewebefragmente enthält. Stellen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad bei 37 °C und inkubieren Sie es 1,5 h lang; Schütteln Sie die Tube alle 20 min.
3. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie 20 ml der Neutralisationslösung injizieren. Mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren ~15x.
4. Filtrieren Sie das Gemisch durch einen 100 μm Maschenfilter. Bei 156 × g 5 min zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Inkubation des Pellets mit 20 ml Neutralisationslösung. Mischen Sie den Inhalt durch 15-faches Pipettieren und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 156 × g .
6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL Anfangskulturmedium. Plattieren Sie die Zellsuspension in einer 100-mm-Zellkulturschale.
7. Kultivieren Sie die Zellen in einem 5% CO₂ -Inkubator bei 37 °C. Ersetzen Sie das ursprüngliche Kulturmedium jeden dritten Tag durch frisches Epithelzellmedium. Überprüfen Sie die Zellen und erneuern Sie das Medium alle 2 Tage.

4. Zell-Passaging

1. Nehmen Sie die 100-mm-Schale aus dem Inkubator, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, entsorgen Sie das verwendete Medium und spülen Sie die Schale 2x mit 2 ml PBS aus. Entfernen Sie PBS und geben Sie dann 2 ml 0,05% Trypsin in jede 100-mm-Schale.
   HINWEIS: Schwenken Sie die Schale, um sicherzustellen, dass die Trypsinlösung ausreichend Kontakt mit dem Boden der Schale hat.
2. Stellen Sie die 100-mm-Schale für ~7 min in einen 37 °C Inkubator für den Aufschluss.
3. Untersuchen Sie die Zellen mit einem Mikroskop und einem 40-fach-Objektiv, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen vom Boden der Schale dissoziiert wurden.
4. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie 8 mL Neutralisationslösung hinzufügen und die Zellen in ein 15 mL Röhrchen überführen. Mischen Sie die Zellen, indem Sie 10-15x auf und ab pipettieren. Die Zellen bei 156 × g 5 min zentrifugieren.
5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml Epithelzellmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
6. 1 × 10⁶ Zellen in 10 ml Epithelzellmedium in eine 100-mm-Schale geben.
7. Frischen Sie das Epithelzellmedium auf und beobachten Sie die Zellen alle 2 Tage.

5. Kryokonservierung von Zellen

1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4.
2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Kryokonservierungslösung.
3. Übertragen Sie 1 ml der Kryokonservierungslösung, die die Zellen enthält, in jedes kryogene Fläschchen.
4. Notieren Sie die Namen der kryokonservierten Zellen, die Durchgangsnummern und die Daten.
5. Stellen Sie die Fläschchen über Nacht in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Geschwindigkeit bei -80 °C.
6. Nehmen Sie die kryogenen Fläschchen aus dem -80 °C-Gefrierschrank und überführen Sie sie schnell in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Schema des Vorgehens. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung einer Kombination von Enzymen, nämlich Dispase, Kollagenase und Trypsin. Diese Kombination wird zu dem Zweck verwendet, die Epithelschicht von der darunter liegenden Fibroblastenschicht abzulösen und anschließend Trypsin zu verwenden, um die Brustepithelzellen in eine Suspension zu dissoziieren. Darüber hinaus wurde das Wachstum von Epithelzellen durch Zugabe von Y-27632 zum ursprünglichen Kulturmedium e...

Diskussion

HMECs sind für die Erhaltung der anatomischen und funktionellen Integrität von Brustgewebe von entscheidender Bedeutung und sie sind nützlich in wissenschaftlichen Untersuchungen, klinischen Implementierungen und verwandten Bereichen¹⁵. Primäre Epithelzellen sind eine Art spezialisierter Zellen mit begrenzten Passagen und kürzerer Lebensdauer. Das Wachstum von HMECs wurde jedoch durch technische Einschränkungen behindert, die folglich die Fortschritte in der Forschung bei Brustkrebs und ande...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor