Isolamento e Cultura de Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias

Resumo

O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

Resumo

A glândula mamária é uma estrutura fundamental da mama e desempenha um papel essencial na reprodução. As células epiteliais mamárias humanas (HMECs), que são as células de origem do câncer de mama e outras doenças inflamatórias relacionadas à mama, têm atraído atenção considerável. No entanto, isolar e cultivar HMECs primários in vitro para fins de pesquisa tem sido um desafio devido à sua natureza altamente diferenciada e queratinizada e sua curta vida útil. Portanto, desenvolver um método simples e eficiente para isolar e cultivar HMECs é de grande valor científico para o estudo da biologia da mama e doenças relacionadas à mama. Neste estudo, isolamos com sucesso os HMECs primários de pequenas quantidades de tecido mamário por digestão com uma mistura de enzimas combinada com uma cultura inicial em soro fetal bovino-DMEM a 5% contendo o inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de expansão da cultura em meio de queratinócitos sem soro. Essa abordagem promove seletivamente o crescimento de células epiteliais, resultando em um rendimento celular otimizado. A simplicidade e conveniência desse método o tornam adequado para pesquisas laboratoriais e clínicas, que devem fornecer informações valiosas sobre essas importantes áreas de estudo.

Introdução

O câncer de mama é o principal tipo de câncer diagnosticado em mulheres em todo o mundo e é a principal causa de morte por câncer¹. A patogênese do câncer de mama é complexa, envolvendo múltiplos fatores, como genética, ambiente e estilo de vida. HMECs, células produtoras de leite ativas, são um dos componentes mais importantes do tecido mamário e provavelmente são as células originais envolvidas na carcinogênese do câncer de mama. Portanto, os HMECs têm recebido mais atenção dos pesquisadores para o estudo do câncer de mama². Além disso, as células primárias têm a capacidade de fornecer uma caracterização biologicamente relevante de processos celulares complexos devido à retenção de estabilidade genética, morfologia normal e um conjunto mais completo de funções celulares básicas que não podem ser alcançadas com linhagens celulares imortalizadas³. Portanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são uma etapa essencial para o estudo da maioria das doenças relacionadas à mama, como câncer de mama e doenças inflamatórias da mama.

Atualmente, um sistema estável e reprodutível para o isolamento, cultura e identificação de células epiteliais mamárias de ratos, vacas, porcos e cabras foi estabelecido 4,5,6,7. No entanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são desafiadores devido ao microambiente complexo e ao baixo rendimento das células. Durante décadas, os cientistas têm procurado o método mais eficaz para isolar e cultivar HMECs, embora um sistema de cultura para HMECs tenha sido estabelecido há quase 20 anos. Por exemplo, Hammond et al. desenvolveram um meio de cultura sem soro no qual os HMECs cresceram eficientemente⁸. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. testaram quatro métodos de isolamento diferentes usando procedimentos de digestão enzimática rápida/lenta combinados com filtração sequencial ou etapas de centrifugação diferencial para obter HMECs⁹. Eles descobriram que o método de digestão lenta, juntamente com a centrifugação diferencial, é o método mais eficiente para isolar HMECs do tecido mamário fresco. No entanto, esse método de isolamento requer grandes pedaços de tecido (40-75 g) e usa maiores quantidades de enzimas de digestão. Seu procedimento é complicado (pelo menos três centrifugações diferentes para obter diferentes frações celulares), além de demorado. Portanto, ainda é necessário um método simples e rápido para obter eficientemente populações de HMECs a partir de pequenas quantidades de tecido mamário para pesquisa e aplicações clínicas⁹.

Nossos estudos anteriores mostraram que a adição do inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632 no meio de cultura inicial pode simplificar o processo de isolamento de células epidérmicas da pele humana¹⁰, que também tem sido usado com sucesso para o isolamento de células epiteliais gengivais¹¹. Além disso, pesquisas anteriores conduzidas pelo grupo de Zubeldia-Plazaola e pelo grupo de Jin indicaram que o Y-27632 tem a capacidade de estimular o crescimento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliais primárias derivadas do tecido mamário ^9,12. O presente estudo teve como objetivo testar se o uso de Y-27632 simplificaria o isolamento e a cultura de HMECs e estabelecemos com sucesso um método simples e de fácil execução para isolar HMECs de pequenos pedaços (1 g) de tecido mamário.

Protocolo

Os tecidos mamários normais frescos usados neste protocolo são coletados da cirurgia ao redor da lesão de mastite lobular granulomatosa refratária no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang, de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).

1. Aquisição de tecido

1. Colete tecidos mamários frescos de espécimes cirúrgicos retirados de mulheres adultas em tubos estéreis contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com penicilina/estreptomicina a 3% (P/S).
   NOTA: Os tecidos mamários devem ser manuseados de acordo com os seguintes detalhes dentro de 24 horas após a coleta da cirurgia.

2. Pré-tratamento do tecido

1. Remova o tecido adiposo do tecido mamário com dois pares de pinças, garantindo que o tecido mamário restante tenha ~ 1 g de peso.
2. Enxaguar o tecido mamário em solução de etanol a 75% (5 mL) por 5 s e depois lavar com 20 mL de solução de lavagem (Tabela 1) por 2 x 5 min.

3. Digestão do tecido

1. Corte o tecido mamário em fragmentos menores, triturando o tecido usando duas lâminas cirúrgicas por um período de 15 min para obter o homogeneizado do tecido. Transfira os pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Adicione 10 mL de dispase 5,0 mg/mL + solução de colagenase 5,0 mg/mL, 3 mL de tripsina a 0,25% e 7 mL de PBS a um total de 20 mL de solução de digestão em um tubo de centrifugação de 50 mL que contém os fragmentos de tecido mamário. Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C e incubar durante 1,5 h; agite o tubo a cada 20 min.
3. Pare o processo de digestão injetando 20 mL da solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando ~ 15x.
4. Filtrar a mistura através de um filtro de malha de 100 μm. Centrifugue a 156 × g por 5 min.
5. Remover o sobrenadante e repetir a incubação do sedimento com 20 ml de solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando 15x e centrifugue a 156 × g por 5 min.
6. Remova o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda o pellet celular com 10 mL de meio de cultura inicial. Colocar a suspensão de células numa placa de cultura de células de 100 mm.
7. Cultive as células em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C. Substitua o meio de cultura original por meio de células epiteliais frescas a cada três dias. Verifique as células e atualize o meio a cada 2 dias.

4. Passagem celular

1. Remova o prato de 100 mm da incubadora quando as células atingirem 80%-90% de confluência, descarte o meio usado e enxágue o prato 2x com 2 mL de PBS. Remova o PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina a 0,05% em cada placa de 100 mm.
   NOTA: Agite o prato para certificar-se de que a solução de tripsina tenha contato suficiente com o fundo do prato.
2. Coloque o prato de 100 mm em uma incubadora a 37 °C por ~7 min para o processo de digestão.
3. Examine as células com um microscópio usando uma objetiva de 40x para garantir que a maioria das células tenha sido dissociada do fundo do prato.
4. Pare o processo de digestão adicionando 8 mL de solução neutralizante e transfira as células para um tubo de 15 mL. Misture as células pipetando para cima e para baixo 10-15x. Centrifugue as células a 156 × g durante 5 min.
5. Remova o sobrenadante com cuidado, ressuspenda as células com 10 mL de meio de células epiteliais e conte o número de células.
6. Adicionar 1 × 10⁶ células em 10 ml de meio de células epiteliais numa placa de 100 mm.
7. Atualize o meio celular epitelial e observe as células a cada 2 dias.

5. Criopreservação celular

1. Repita as etapas 4.1-4.4.
2. Remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda as células em 2 mL de solução de criopreservação celular.
3. Transfira 1 mL da solução de criopreservação contendo as células para cada frasco criogênico.
4. Registre os nomes das células criopreservadas, os números das passagens e as datas.
5. Coloque os frascos para injetáveis em um recipiente de congelamento a -80 °C durante a noite.
6. Remova os frascos criogênicos do freezer a -80 ° C e transfira-os rapidamente para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

Resultados

A Figura 1 mostra um esquema do procedimento. O protocolo envolve o uso de uma combinação de enzimas, a saber, dispase, colagenase e tripsina. Essa combinação é utilizada com o objetivo de separar a folha epitelial da camada de fibroblastos abaixo dela e, posteriormente, utilizar a tripsina para dissociar as células epiteliais mamárias em uma suspensão. Além disso, o crescimento de células epiteliais foi efetivamente promovido pela adição de Y-27632 ao meio de cultura inicial. Co...

Discussão

Os HMECs são vitais na preservação da integridade anatômica e funcional do tecido mamário e são úteis em investigações científicas, implementações clínicas e domínios associados¹⁵. As células epiteliais primárias são um tipo de células especializadas que têm passagens limitadas e vida útil mais curta. No entanto, o crescimento dos HMECs tem sido dificultado por restrições técnicas, que consequentemente dificultam os avanços da pesquisa em câncer de mama e outras doenças i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor