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요약

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

초록

유선은 유방의 기본 구조이며 생식에 필수적인 역할을 합니다. 유방암 및 기타 유방 관련 염증성 질환의 기원 세포인 인간 유방 상피 세포(HMECs)는 상당한 주목을 받고 있습니다. 그러나 연구 목적으로 1차 HMEC를 체외에서 분리하고 배양하는 것은 고도로 분화되고 각질화된 특성과 짧은 수명으로 인해 어려운 일이었습니다. 따라서 HMEC를 분리하고 배양하는 간단하고 효율적인 방법을 개발하는 것은 유방 생물학 및 유방 관련 질환 연구에 큰 과학적 가치가 있습니다. 이 연구에서는 Rho-associated kinase(ROCK) 억제제 Y-27632가 함유된 5% 소 태아 혈청-DMEM에서 초기 배양과 결합된 효소 혼합물로 소화하여 소량의 유방 조직에서 일차 HMEC를 성공적으로 분리한 후 무혈청 각질세포 배지에서 배양 팽창했습니다. 이 접근법은 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진하여 최적화된 세포 수율을 제공합니다. 이 방법의 단순성과 편리성으로 인해 실험실 및 임상 연구 모두에 적합하며, 이러한 중요한 연구 영역에 대한 귀중한 통찰력을 제공해야 합니다.

서문

유방암은 전 세계적으로 여성에게 진단되는 주요 유형의 암이며 암으로 인한 주요 사망 원인입니다1. 유방암의 발병 기전은 유전학, 환경, 생활 방식과 같은 여러 요인이 관련되어 복잡합니다. 활성 우유 생산 세포인 HMEC는 유방 조직의 가장 중요한 구성 요소 중 하나이며 유방암 발암에 관여하는 원래 세포일 가능성이 높습니다. 따라서 HMEC은 유방암 연구에서 연구자들로부터 가장 많은 주목을 받고 있다2. 또한, 일차 세포는 유전적 안정성, 정상적인 형태 및 불멸화된 세포주로는 달성할 수 없는 보다 완전한 기본 세포 기능 세트를 유지함으로써 복잡한 세포 과정에 대한 생물학적으로 관련된 특성을 제공할 수 있는 능력을 가지고 있습니다3. 따라서 일차 HMEC의 격리 및 배양은 유방암 및 유방 염증성 질환과 같은 대부분의 유방 관련 질환 연구에 필수적인 단계입니다.

현재 쥐, 소, 돼지 및 염소로부터 유방 상피 세포의 분리, 배양 및 식별을 위한 안정적이고 재현 가능한 시스템이 확립되었습니다 4,5,6,7. 그러나 1차 HMEC의 분리 및 배양은 복잡한 미세환경과 세포의 낮은 수율로 인해 까다롭습니다. 수십 년 동안 과학자들은 HMEC를 분리하고 배양할 수 있는 가장 효과적인 방법을 찾고 있었지만 HMEC를 위한 배양 시스템이 거의 20년 전에 확립되었습니다. 예를 들어, Hammond et al.은 HMEC가 효율적으로 성장하는 무혈청 배양 배지를 개발했습니다8. 최근 Zubeldia-Plazaola 등은 HMEC를 얻기 위해 순차 여과 또는 차등 원심분리 단계와 결합된 빠른/느린 효소 분해 절차를 사용하여 4가지 다른 분리 방법을 테스트했습니다9. 그들은 차등 원심분리와 함께 느린 소화 방법이 신선한 유방 조직에서 HMEC를 분리하는 가장 효율적인 방법이라는 것을 발견했습니다. 그러나 이 분리 방법은 큰 조직 조각(40-75g)이 필요하고 더 많은 양의 소화 효소를 사용합니다. 그들의 절차는 복잡하고(서로 다른 세포 분획을 얻기 위해 최소 세 가지 다른 원심분리) 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 연구 및 임상 응용을 위해 소량의 유방 조직에서 HMEC의 집단을 효율적으로 얻기 위해서는 여전히 간단하고 빠른 방법이 필요하다9.

우리의 이전 연구는 Rho-associated kinase (ROCK) 억제제 Y-27632를 초기 배양 배지에 첨가하면 인간 피부 표피 세포(10)를 분리하는 과정을 단순화할 수 있음을 보여주었으며, 이는 치은 상피 세포(11)의 분리에도 성공적으로 사용되었습니다. 또한, Zubeldia-Plazaola 연구팀과 Jin 연구팀이 실시한 선행 연구에 따르면 Y-27632는 유방 조직 9,12에서 유래한 일차 상피세포의 빠르고 무제한적인 체외 성장을 자극할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 Y-27632를 사용하면 HMEC의 분리 및 배양이 단순화되는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 했으며, 유방 조직의 작은 조각(1g)에서 HMEC를 분리하는 간단하고 쉽게 수행할 수 있는 방법을 성공적으로 확립했습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 신선한 정상 유방 조직은 저장성 중문대학교 제1부속병원 의료윤리위원회의 지침에 따라 저장중의과대학 제1부속병원에서 난치성 육아종성 소엽유선염의 병변 주위 수술에서 채취한 것입니다(의정서 번호. ChiMCTR2100005281, 날짜: 2017-07-17).

1. 조직의 획득

  1. 성인 여성에서 채취한 수술 표본에서 신선한 유방 조직을 3% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 멸균 튜브에 수집합니다.
    참고: 유방 조직은 수술 후 채취 후 24시간 이내에 다음 세부 사항에 따라 처리해야 합니다.

2. 조직의 전처리

  1. 두 쌍의 집게로 유방 조직에서 지방 조직을 제거하고 나머지 유방 조직의 무게가 ~1g이 되도록 합니다.
  2. 유방 조직을 75% 에탄올 용액(5mL)에 5초 동안 헹구고 20mL의 세척 용액(표 1)으로 2 x 5분 동안 세척합니다.

3. 조직의 소화

  1. 유방 조직을 더 작은 조각으로 자르고 두 개의 수술용 칼날을 사용하여 15분 동안 조직을 파쇄하여 조직 균질화를 얻습니다. 조직 조각을 50mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
  2. 유방 조직 조각이 들어있는 50mL 원심분리 튜브에 총 20mL의 분해 용액에 5.0mg/mL 디스파제 + 5.0mg/mL 콜라겐분해 효소 용액 5.0mL, 0.25% 트립신 3mL, PBS 7mL를 추가합니다. 튜브를 37 ° C의 수조에 넣고 1.5 시간 동안 배양하십시오. 20분마다 튜브를 흔듭니다.
  3. 중화 용액 20mL를 주입하여 분해 과정을 중지합니다. 피펫팅으로 내용물을 ~15배 섞습니다.
  4. 100μm 메쉬 필터를 통해 혼합물을 여과합니다. 156 × g 에서 5분 동안 원심분리기
  5. 상층액을 제거하고 20mL의 중화 용액으로 펠릿의 배양을 반복합니다. 피펫팅으로 15배를 섞고 156× g 에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.
  6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 초기 배양 배지 10mL로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시에 담습니다.
  7. 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 원래 배양 배지를 3일마다 새로운 상피 세포 배지로 교체합니다. 셀을 확인하고 2일마다 배지를 새로 고칩니다.

4. 세포 통과

  1. 세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 인큐베이터에서 100mm 접시를 제거하고 사용한 배지를 버리고 접시를 2mL의 PBS로 2번 헹굽니다. PBS를 제거한 다음 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다.
    알림: 트립신 용액이 접시 바닥에 충분히 닿도록 접시를 휘젓습니다.
  2. 분해 과정을 위해 100mm 접시를 37°C 인큐베이터에 ~7분 동안 넣습니다.
  3. 40x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 세포를 검사하여 대부분의 세포가 접시 바닥에서 분리되었는지 확인합니다.
  4. 8mL의 중화 용액을 추가하여 분해 과정을 중지하고 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 위아래로 10-15x 피펫팅하여 세포를 혼합합니다. 156× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
  5. 상층액을 조심스럽게 제거하고 10mL의 상피 세포 배지로 세포를 재현탁시키고 세포 수를 계산합니다.
  6. 100mm 접시에 10mL의 상피 세포 배지에 1 × 106 세포를 추가합니다.
  7. 상피 세포 배지를 새로 고치고 2일마다 세포를 관찰합니다.

5. 세포 동결 보존

  1. 4.1-4.4단계를 반복합니다.
  2. 상층액을 조심스럽게 제거하고 2mL의 세포 동결 보존 용액에 세포를 재현탁시킵니다.
  3. 세포가 들어있는 동결 보존 용액 1mL를 각 극저온 바이알에 옮깁니다.
  4. 냉동 보존된 세포의 이름, 통로 번호 및 날짜를 기록하십시오.
  5. 바이알을 -80 °C의 제어된 속도 냉동 용기에 밤새 넣습니다.
  6. -80 °C 냉동고에서 극저온 바이알을 제거하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 빠르게 옮깁니다.

결과

그림 1 은 절차의 개략도를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 효소, 즉 dispase, collagenase 및 trypsin의 조합이 사용됩니다. 이 조합은 그 아래의 섬유아세포층에서 상피 시트를 분리하고 이어서 트립신을 사용하여 유방 상피 세포를 현탁액으로 해리시키는 목적으로 사용됩니다. 또한, 상피 세포의 성장은 초기 배양 배지에 Y-27632를 첨가함으로써 효과적으로 촉진되었습니다. 결과적으...

토론

HMEC는 유방 조직의 해부학적 및 기능적 무결성을 보존하는 데 필수적이며 과학적 조사, 임상 구현 및 관련 영역에서 유용합니다15. 일차 상피 세포는 통로가 제한되고 수명이 짧은 특수 세포의 한 유형입니다. 그러나 HMEC의 성장은 기술적 제약으로 인해 방해를 받아왔으며, 이는 결과적으로 유방암 및 유방과 관련된 기타 염증성 질환에 대한 연구 발전을 저해해 왔다...

공개

저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 저장성 한의학과학기술프로그램(2017ZA055; 2018ZA036), 중국 구이저우성 주이(Zunyi)의 과학기술프로젝트(Zunyi City Kehe Support NS(2020) No. 18)에서 X. Xu. 저자들은 세포 배양 교육을 제공한 Youjia(Hangzhou) Biomedical Technology Company의 분자 생물학 실험실에 감사를 표합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% TrypsinBasalmediaK431010For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge TubesNEST081722CK01For cell digestion
100 µm mesh filterSolarbio431752For HMECs filtration
100 mm Cell Culture DishCorning430167For cell culture
4% paraformaldehydesolarbioP1110-100mlFor immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge TubeCorning430829For cell centrifugation
Cell StrainerSolarbio431752Cell filtration
CentrifugeEppendorf5404HN133048Cell centrifuge
CO2 IncubatorThermo Scientific42820906For cell incubation
Collagenase Type IMerckSKU:SCR103For HMECs isolation
Dispase SolarbioCAS:42613-33-2For HMECs isolation
DMEMGibco8122622Component of neutralization medium
Fetal Bovine SerumGibco2556132PComponent of neutralization medium
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140-122Antibiotics
Phosphate buffered solutionTecono20201033Washing solution
rabbit anti CK7abcamab68459For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3abcamab199428For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632SolarbioIY0040ROCK inhibitor

참고문헌

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