Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

요약

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

초록

유선은 유방의 기본 구조이며 생식에 필수적인 역할을 합니다. 유방암 및 기타 유방 관련 염증성 질환의 기원 세포인 인간 유방 상피 세포(HMECs)는 상당한 주목을 받고 있습니다. 그러나 연구 목적으로 1차 HMEC를 체외에서 분리하고 배양하는 것은 고도로 분화되고 각질화된 특성과 짧은 수명으로 인해 어려운 일이었습니다. 따라서 HMEC를 분리하고 배양하는 간단하고 효율적인 방법을 개발하는 것은 유방 생물학 및 유방 관련 질환 연구에 큰 과학적 가치가 있습니다. 이 연구에서는 Rho-associated kinase(ROCK) 억제제 Y-27632가 함유된 5% 소 태아 혈청-DMEM에서 초기 배양과 결합된 효소 혼합물로 소화하여 소량의 유방 조직에서 일차 HMEC를 성공적으로 분리한 후 무혈청 각질세포 배지에서 배양 팽창했습니다. 이 접근법은 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진하여 최적화된 세포 수율을 제공합니다. 이 방법의 단순성과 편리성으로 인해 실험실 및 임상 연구 모두에 적합하며, 이러한 중요한 연구 영역에 대한 귀중한 통찰력을 제공해야 합니다.

서문

유방암은 전 세계적으로 여성에게 진단되는 주요 유형의 암이며 암으로 인한 주요 사망 원인입니다¹. 유방암의 발병 기전은 유전학, 환경, 생활 방식과 같은 여러 요인이 관련되어 복잡합니다. 활성 우유 생산 세포인 HMEC는 유방 조직의 가장 중요한 구성 요소 중 하나이며 유방암 발암에 관여하는 원래 세포일 가능성이 높습니다. 따라서 HMEC은 유방암 연구에서 연구자들로부터 가장 많은 주목을 받고 있다². 또한, 일차 세포는 유전적 안정성, 정상적인 형태 및 불멸화된 세포주로는 달성할 수 없는 보다 완전한 기본 세포 기능 세트를 유지함으로써 복잡한 세포 과정에 대한 생물학적으로 관련된 특성을 제공할 수 있는 능력을 가지고 있습니다³. 따라서 일차 HMEC의 격리 및 배양은 유방암 및 유방 염증성 질환과 같은 대부분의 유방 관련 질환 연구에 필수적인 단계입니다.

현재 쥐, 소, 돼지 및 염소로부터 유방 상피 세포의 분리, 배양 및 식별을 위한 안정적이고 재현 가능한 시스템이 확립되었습니다 4,5,6,7.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 신선한 정상 유방 조직은 저장성 중문대학교 제1부속병원 의료윤리위원회의 지침에 따라 저장중의과대학 제1부속병원에서 난치성 육아종성 소엽유선염의 병변 주위 수술에서 채취한 것입니다(의정서 번호. ChiMCTR2100005281, 날짜: 2017-07-17).

1. 조직의 획득

1. 성인 여성에서 채취한 수술 표본에서 신선한 유방 조직을 3% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 멸균 튜브에 수집합니다.
   참고: 유방 조직은 수술 후 채취 후 24시간 이내에 다음 세부 사항에 따라 처리해야 합니다.

2. 조직의 전처리

1. 두 쌍의 집게로 유방 조직에서 지방 조직을 제거하고 나머지 유방 조직의 무게가 ~1g이 되도록 합니다.
2. 유방 조직을 75% 에탄올 용액(5mL)에 5초 동안 헹구고 20mL의 세척 용액(표 1)으로 2 x 5분 동안 세척합니다.

3. 조직의 소화

1. 유방 ....

토론

HMEC는 유방 조직의 해부학적 및 기능적 무결성을 보존하는 데 필수적이며 과학적 조사, 임상 구현 및 관련 영역에서 유용합니다¹⁵. 일차 상피 세포는 통로가 제한되고 수명이 짧은 특수 세포의 한 유형입니다. 그러나 HMEC의 성장은 기술적 제약으로 인해 방해를 받아왔으며, 이는 결과적으로 유방암 및 유방과 관련된 기타 염증성 질환에 대한 연구 발전을 저해해 왔다^.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor