Выделение и культивирование первичных эпителиальных клеток молочной железы человека

Резюме

В настоящем исследовании сообщается о более простом, экономящем время и экономичном протоколе для эффективной изоляции и выращивания первичных эпителиальных клеток молочной железы человека (HMEC) из небольшого количества ткани молочной железы. Этот протокол подходит для быстрого производства первичных HMEC как для лабораторного, так и для клинического применения.

Аннотация

Молочная железа является основной структурой молочной железы и играет важную роль в размножении. Эпителиальные клетки молочной железы человека (HMEC), которые являются исходными клетками рака молочной железы и других воспалительных заболеваний, связанных с молочной железой, привлекли значительное внимание. Тем не менее, выделение и культивирование первичных HMEC in vitro для исследовательских целей было сложной задачей из-за их высокодифференцированной, ороговевшей природы и короткого срока жизни. Таким образом, разработка простого и эффективного метода выделения и культивирования HMECs имеет большую научную ценность для изучения биологии молочной железы и заболеваний, связанных с молочной железой. В этом исследовании мы успешно выделили первичные HMECs из небольших количеств ткани молочной железы путем переваривания смесью ферментов в сочетании с исходной культурой в 5% сыворотке плода крупного рогатого скота DMEM, содержащей ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632, с последующим расширением культуры в бессывороточной кератиноцитарной среде. Этот подход избирательно способствует росту эпителиальных клеток, что приводит к оптимизированному выходу клеток. Простота и удобство этого метода делают его пригодным как для лабораторных, так и для клинических исследований, которые должны дать ценную информацию об этих важных областях исследований.

Введение

Рак молочной железы является основным типом рака, диагностируемым у женщин во всем мире, и основной причиной смерти от рака¹. Патогенез рака молочной железы сложен и включает в себя множество факторов, таких как генетика, окружающая среда и образ жизни. HMECs, активные молочные клетки, являются одним из наиболее важных компонентов ткани молочной железы и, вероятно, являются исходными клетками, участвующими в канцерогенезе рака молочной железы. Таким образом, HMEC привлекли наибольшее внимание исследователей для изучения рака молочной железы². Кроме того, первичные клетки обладают способностью обеспечивать биологически значимую характеристику сложных клеточных процессов благодаря сохранению ими генетической стабильности, нормальной морфологии и более полного набора основных клеточных функций, которые не могут быть достигнуты с помощью иммортализованных клеточных линий^. Таким образом, выделение и культивирование первичных HMECs является важным шагом для изучения большинства заболеваний, связанных с молочной железой, таких как рак молочной железы и воспалительные заболевания молочной железы.

В настоящее время создана стабильная и воспроизводимая система выделения, культивирования и идентификации эпителиальных клеток молочных желез крыс, коров, свиней и коз 4,5,6,7. Тем не менее, выделение и культивирование первичных ГМЭК является сложной задачей из-за сложного микроокружения и низкого выхода клеток. На протяжении десятилетий ученые искали наиболее эффективный метод выделения и культивирования HMEC, хотя система культивирования HMEC была создана почти 20 лет назад. Например, Hammond et al. разработали бессывороточную питательную среду, в которой эффективно выращивались HMEC⁸. Недавно Zubeldia-Plazaola et al. протестировали четыре различных метода выделения с использованием процедур быстрого/медленного расщепления ферментов в сочетании с последовательной фильтрацией или дифференциальными стадиями центрифугирования для получения HMEC⁹. Они обнаружили, что метод медленного разложения в сочетании с дифференциальным центрифугированием является наиболее эффективным методом выделения HMECs из свежей ткани молочной железы. Тем не менее, этот метод выделения требует больших кусочков ткани (40-75 г) и использует большее количество ферментов для пищеварения. Их процедура сложна (не менее трех разных центрифугирований для получения разных фракций клеток), а также трудоемка. Таким образом, по-прежнему необходим простой и быстрый метод для эффективного получения популяций HMECs из небольших количеств ткани молочной железы для исследований и клинического применения⁹.

Наши предыдущие исследования показали, что добавление ингибитора Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632 в исходную культуральную среду может упростить процесс выделения эпидермальных клеток кожи человека¹⁰, который также был успешно использован для выделения эпителиальных клеток десны¹¹. Кроме того, более ранние исследования, проведенные группой Зубельдии-Плазаолы и группой Джина, показали, что Y-27632 обладает способностью стимулировать быстрый и неограниченный рост in vitro первичных эпителиальных клеток, полученных из ткани молочной железы ^9,12. Целью настоящего исследования было проверить, упростит ли использование Y-27632 выделение и культивирование HMECs, и мы успешно разработали простой и легко выполняемый метод выделения HMECs из небольших кусочков (1 г) молочной ткани.

протокол

Свежие нормальные ткани молочной железы, используемые в этом протоколе, собираются в результате хирургического вмешательства вокруг очага рефрактерного гранулематозного лобулярного мастита в Первой аффилированной больнице Чжэцзянского китайского медицинского университета в соответствии с рекомендациями Комитета по медицинской этике Первой аффилированной больницы Чжэцзянского китайского медицинского университета (протокол No. ChiMCTR2100005281, дата: 2017-07-17).

1. Приобретение тканей

1. Соберите свежие ткани молочных желез из хирургических образцов, взятых у взрослых женщин, в стерильные пробирки, содержащие 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с 3% пенициллином/стрептомицином (P/S).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани молочной железы следует обрабатывать в соответствии со следующими деталями в течение 24 часов после забора после операции.

2. Предварительная обработка тканей

1. Удалите жировую ткань из ткани молочной железы с помощью двух пар щипцов, следя за тем, чтобы оставшаяся ткань молочной железы весила ~1 г.
2. Промойте ткань молочной железы в 75% растворе этанола (5 мл) в течение 5 с, а затем промойте 20 мл моющего раствора (Таблица 1) в течение 2 х 5 минут.

3. Переваривание тканей

1. Разрежьте ткань молочной железы на более мелкие фрагменты, измельчая ткань с помощью двух хирургических лезвий в течение 15 минут, чтобы получить гомогенат ткани. Перенесите кусочки ткани в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
2. Добавьте 10 мл раствора коллагеназы 5,0 мг/мл диспаза + 5,0 мг/мл коллагеназы, 3 мл 0,25% трипсина и 7 мл PBS в общей сложности 20 мл раствора для разложения в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую фрагменты ткани молочной железы. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C и выдерживайте в течение 1,5 ч; Встряхивайте трубку каждые 20 минут.
3. Остановите процесс разложения, введя 20 мл нейтрализующего раствора. Перемешайте содержимое с помощью пипетирования ~15x.
4. Отфильтруйте смесь через сетчатый фильтр 100 мкм. Центрифугировать при 156 × г в течение 5 мин.
5. Удалите надосадочную жидкость и повторите инкубацию гранулы с 20 мл нейтрализующего раствора. Смешайте содержимое с помощью пипетки 15x и центрифугируйте при 156 × г в течение 5 минут.
6. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 мл исходной питательной среды. Поместите клеточную суспензию в чашку для клеточных культур диаметром 100 мм.
7. Культивируйте клетки в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C. Заменяйте исходную питательную среду свежей средой для эпителиальных клеток каждые три дня. Проверяйте клетки и обновляйте среду каждые 2 дня.

4. Пассирование клеток

1. Выньте чашку диаметром 100 мм из инкубатора, когда клетки достигнут 80%-90% конфлюенции, выбросьте использованную среду и промойте чашку 2 мл PBS. Удалите PBS, а затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина в каждую 100-миллиметровую чашку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поворачивайте чашку, чтобы убедиться, что раствор трипсина имеет достаточный контакт со дном чашки.
2. Поместите чашку диаметром 100 мм в инкубатор с температурой 37 °C на ~7 минут для процесса пищеварения.
3. Исследуйте клетки с помощью микроскопа с помощью объектива с 40-кратным увеличением, чтобы убедиться, что большая часть клеток была диссоциирована от дна чашки.
4. Остановите процесс пищеварения, добавив 8 мл нейтрализующего раствора, и перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл. Перемешайте клетки, пипетируя вверх и вниз 10-15 раз. Центрифугируйте клетки при 156 × г в течение 5 минут.
5. Осторожно удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки 10 мл эпителиальной клеточной среды и подсчитайте количество клеток.
6. Добавьте 1 × 10⁶ клеток в 10 мл эпителиальной клеточной среды в чашке диаметром 100 мм.
7. Обновляйте эпителиальную клеточную среду и наблюдайте за клетками каждые 2 дня.

5. Криоконсервация клеток

1. Повторите шаги 4.1-4.4.
2. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл раствора для криоконсервации клеток.
3. Перелейте 1 мл раствора для криоконсервации, содержащего клетки, в каждый криогенный флакон.
4. Запишите названия криоконсервированных камер, номера проходов и даты.
5. Поместите флаконы в контейнер с контролируемой скоростью заморозки при температуре -80 °C на ночь.
6. Достаньте криогенные флаконы из морозильной камеры при температуре -80 °C и быстро переложите их в жидкий азот для длительного хранения.

Результаты

На рисунке 1 показана схема процедуры. Протокол предполагает использование комбинации ферментов, а именно диспазы, коллагеназы и трипсина. Эту комбинацию используют с целью отделения эпителиального листа от слоя фибробластов под ним и последующего использования трипс...

Обсуждение

HMEC жизненно важны для сохранения анатомической и функциональной целостности ткани молочной железы, а также полезны в научных исследованиях, клинических реализациях и связанных с ними областях¹⁵. Первичные эпителиальные клетки — это тип специализированных клеток, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor