طرق بديلة للكشف عن توليد أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية

Summary

يعد توليد أنيون الأكسيد الفائق ضروريا لتحفيز الصفائح الدموية ، وإذا كان غير منظم ، فهو ضروري للأمراض الخثارية. هنا ، نقدم ثلاثة بروتوكولات للكشف الانتقائي عن أنيونات الأكسيد الفائق ودراسة تنظيم الصفائح الدموية المعتمدة على الأكسدة والاختزال.

Abstract

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تحتوي على الأكسجين غير مستقرة للغاية. عدم استقرارها الكيميائي يجعلها شديدة التفاعل ويمنحها القدرة على التفاعل مع جزيئات حيوية مهمة مثل البروتينات والأحماض النووية والليبيدات. أنيونات الأكسيد الفائق هي أنواع الأكسجين التفاعلية المهمة الناتجة عن تقليل الأكسجين الجزيئي (أي الحصول على إلكترون واحد). على الرغم من آثارها الأولية حصريا في عمليات الشيخوخة والتنكسية والمسببة للأمراض ، إلا أن مشاركتها في الاستجابات الفسيولوجية المهمة أصبحت واضحة مؤخرا. في الجهاز الوعائي، ثبت أن الأنيونات فوق الأكسيد تعدل تمايز خلايا العضلات الملساء الوعائية ووظيفتها، وتكاثر الخلايا البطانية الوعائية وهجرتها في تكوين الأوعية، والاستجابة المناعية، وتنشيط الصفائح الدموية في الإرقاء. دور أنيونات الأكسيد الفائق مهم بشكل خاص في عدم تنظيم الصفائح الدموية ومضاعفات القلب والأوعية الدموية المرتبطة بعدد كبير من الحالات ، بما في ذلك السرطان والعدوى والالتهابات والسكري والسمنة. لذلك ، أصبح من المهم للغاية في أبحاث القلب والأوعية الدموية أن تكون قادرة على قياس توليد الأنيونات الفائقة الأكسيد بشكل فعال بواسطة الصفائح الدموية البشرية ، وفهم الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم التوازن بين الإرقاء والتخثر ، وفي النهاية ، تحديد أدوات دوائية جديدة لتعديل استجابات الصفائح الدموية التي تؤدي إلى تجلط الدم ومضاعفات القلب والأوعية الدموية. تقدم هذه الدراسة ثلاثة بروتوكولات تجريبية تم تبنيها بنجاح للكشف عن أنيونات الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية ودراسة الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم الإرقاء والتخثر: 1) اكتشاف أنيون الأكسيد الفائق القائم على ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عن طريق قياس التدفق الخلوي. 2) تصور وتحليل أنيون الأكسيد الفائق القائم على DHE عن طريق تصوير الصفائح الدموية الفردية ؛ و 3) القياس الكمي القائم على المسبار المغزلي لإخراج أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية بواسطة الرنين المغنطيسي للإلكترون (EPR).

Introduction

أنيون الأكسيد الفائق (O₂ ^{• -}) هو أكثر أنواع الأكسجين التفاعلية ذات الصلة وظيفيا المتولدة في الصفائح الدموية¹. O₂ ^{• -} هو نتاج تقليل الأكسجين الجزيئي وسلائف العديد من أنواع ROS ² المختلفة. يؤدي تفكك O₂^•- إلى توليد بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) عن طريق التفاعلات التلقائية في محلول مائي أو تفاعلات تحفزها ديسموتاز الأكسيد الفائق (SODs³). على الرغم من اقتراح مصادر إنزيمية مختلفة (على سبيل المثال ، أوكسيديز الزانثين⁴ ، وأكسيجيناز^{الشحمي 5} ، ....

Protocol

تتم الموافقة على جمع الدم المحيطي من المتطوعين الموافقين من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية وهيئة البحوث الصحية التابعة للخدمات الصحية الوطنية (مرجع REC: 21/SC/0215; معرف IRAS: 283854).

1. الطريقة الأولى: الكشف عن أنيون الأكسيد الفائق باستخدام DHE عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. قم بالتسخين المسبق (37 درجة مئوية) بمحلول سترات الصوديوم (4٪ وزن / حجم) واستخدمه كمضاد للتخثر عن طريق إضافته مباشرة إلى الدم في وقت بزل الوريد بنسبة 1: 7 (0.5٪ وزن / فولت نهائي).
2. سحب الدم البشري المحيطي من المتطوعين الأصحاء عن طريق البزل الوريدي المرفقي المتوسط.
3. الحصول على البلازما الغنية بالصفا....

النتائج

للكشف عن التدفق الخلوي لفلورة DHE ، نعرض نتائج تمثيلية للصفائح الدموية إما تستريح (الشكل 3 أ) أو يتم تحفيزها ب 0.1 وحدة / مل من الثرومبين (الشكل 3 ب). تم قياس ناتج O₂ ^{• -} كشدة مضان متوسط الصفائح الدموية (MFI) ، كما هو موضح للتحفيز با?.......

Discussion

في هذه المخطوطة ، نقدم ثلاث تقنيات مختلفة مع إمكانية تعزيز القدرة على التحقيق في التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال لوظيفة الصفائح الدموية عن طريق الكشف الانتقائي عن O₂ ^{• -}. الطريقتان الأوليان هما تحسين التقنيات الحالية بسبب مسبار الأكسدة والاختزال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope