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요약

과산화물 음이온의 생성은 혈소판의 자극에 필수적이며, 조절이 잘 되지 않는 경우 혈전성 질환에 매우 중요합니다. 여기에서는 과산화물 음이온의 선택적 검출과 산화 환원 의존성 혈소판 조절 연구를 위한 세 가지 프로토콜을 제시합니다.

초록

활성 산소종(ROS)은 매우 불안정한 산소 함유 분자입니다. 화학적 불안정성으로 인해 반응성이 매우 높고 단백질, 핵산 및 지질과 같은 중요한 생물학적 분자와 반응할 수 있는 능력을 제공합니다. 과산화물 음이온은 분자 산소 환원의 감소(즉, 하나의 전자 획득)에 의해 생성되는 중요한 ROS입니다. 초기에는 노화, 퇴행성 및 병원성 과정에만 영향을 미쳤지만, 중요한 생리적 반응에 대한 참여가 최근에 명백해졌습니다. 혈관 시스템에서 과산화물 음이온은 혈관 평활근 세포의 분화 및 기능, 혈관 신생에서 혈관 내피 세포의 증식 및 이동, 면역 반응 및 지혈에서 혈소판의 활성화를 조절하는 것으로 나타났습니다. 과산화물 음이온의 역할은 혈소판의 조절 장애와 암, 감염, 염증, 당뇨병 및 비만을 포함한 다양한 상태와 관련된 심혈관 합병증에 특히 중요합니다. 따라서 인간 혈소판에 의한 과산화물 음이온의 생성을 효과적으로 측정하고, 지혈과 혈전증 사이의 균형을 조절하는 산화 환원 의존 메커니즘을 이해하고, 궁극적으로 혈전증 및 심혈관 합병증으로 이어지는 혈소판 반응의 조절을 위한 새로운 약리학적 도구를 식별할 수 있는 것이 심혈관 연구에서 매우 중요해졌습니다. 이 연구는 혈소판에서 과산화물 음이온을 검출하고 지혈 및 혈전증을 조절하는 산화 환원 의존성 메커니즘에 대한 연구를 위해 성공적으로 채택된 세 가지 실험 프로토콜을 제시합니다: 1) 유세포 분석에 의한 디하이드로에티듐(DHE) 기반 과산화물 음이온 검출; 2) 단일 혈소판 이미징에 의한 DHE 기반 과산화물 음이온 시각화 및 분석; 3) 전자 상자성 공명(EPR)에 의한 혈소판의 과산화물 음이온 출력의 스핀 프로브 기반 정량화.

서문

과산화물 음이온(O2•-)은 혈소판1에서 생성된 가장 기능적으로 관련성이 높은 ROS이다. O2 • -는 분자 산소의 환원의 산물이며 많은 다른 ROS 2 의 전구체입니다. O2 • -의 변이는 수용액에서의 자발적 반응 또는 과산화물 이산 효소 (SOD3 )에 의해 촉매 된 반응을 통해 과산화수소 (H2O2 )의 생성으로 이어집니다. 다양한 효소 공급원이 제안되었지만(예: 크산틴 산화효소4, 리폭시게나제5, 사이클로옥시게나제6 및 산화질소 합성효소7), 미토콘드리아 호흡 8,9 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 산화효소(NOX)10가 진핵 세포에서 과산화물 음이온의 가장 두드러진 공급원입니다. 이것은 또한 미토콘드리아 호흡(11,12)으로부터의 전자 누출과 NOX(13,14)의 효소 활성이 과산화물 음이온 출력의 주요 원인으로 설명 된 혈소판의 경우로 보입니다.

여러 연구가 O2 • -에 의한 혈소판의 조절에 초점을 맞추었지만 책임이있는 분자 메커니즘에 대해서는 합의가 이루어지지 않았습니다. 직접 산화 및 이황화물 결합 형성을 통한 표면 수용체 활성의 조절은 다양한 혈소판 수용체에 대해 제안되었습니다. 시스테인 잔기의 직접 산화를 통한 ROS에 의한 인테그린 αIIbβ3의 양성 조절이 제안되었습니다 15,16,17. 마찬가지로, 콜라겐에 대한 혈소판 반응은 이황화물 의존성 이량체화와 그에 따른 당단백질 VI(GPVI)18의 이량체화에 의존하기 때문에, ROS 의존성 산화에 의한 수용체 활성 강화가 제안되었지만, 실험적으로 완전히 입증되지는 않았지만19. 마지막으로, 당단백질 Ib(GPIb)의 sulfhydryl 그룹의 ROS 유도 산화는 염증 중 혈소판 접착 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 촉진하는 것으로 나타났습니다20. 반대로, sulfhydryl 그룹 산화 및 수용체 활성화 감소의 가능한 결과로서, GPVI 및 GPIb 모두의 ectodomain의 흘림은 조건21을 감소시킴으로써 감소된다.

혈소판 표면 수용체의 직접적인 산화와 독립적인 작용 방식도 제안되었습니다. O2 • -를 포함한 ROS는이 수용체(22)의 신호 캐스케이드를 부정적으로 조절하는 Src 상동 영역 2 함유 단백질 티로신 인산 효소 2 (SHP-2)의 활성을 약화시킴으로써 콜라겐 수용체 GPVI를 긍정적으로 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한,O2•-는 일반적으로 NO-민감성 구아닐릴 사이클라아제(NO-GC)를 통해 혈소판을 억제하는 산화질소(NO)와 빠른 반응에 의해 ONOO-(퍼옥시아질산염)를 생성할 수 있으며, 음극 혈소판 조절제 고리형 GMP(cGMP)23,24의 생성을 억제합니다. 그 결과 NO 수치가 감소하면 혈소판 강화가 발생할 수 있습니다. 대안적으로, NOX2에 의한O2•-의 생성은 혈소판 활성화 및 접착에 필수적인 지질 과산화 및 이소프로스테인 형성에 기여하는 것으로 제안되었습니다25. 마지막으로, 혈소판(26)에서 산화 환원 스트레스 센서로 제안된 단백질 키나아제인 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 세포외 신호 조절 키나아제 5(ERK5)는O2•-에 의해 활성화되고 혈소판에서 응고제 표현형을 유도합니다(포스파티딜세린 외부화의 유세포 측정 기반 측정에 의해 추정됨)27.

혈소판에서O2•- 및 기타 ROS 생성의 조절 장애는 죽상동맥경화증, 진성 당뇨병, 고혈압, 비만 및 암과 관련된 혈전성 심혈관 합병증을 유발하는 과장된 지혈 반응과 관련이 있습니다28,29. 이러한 병리학적 환경에서 혈소판에 의한 ROS 출력이 증가하여 혈소판의 접착 및 응집 반응이 강화됩니다. 혈소판 반응에 미치는 영향 외에도, 혈소판의 활성산소 분비는 다른 혈액 세포 및 혈관 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 심혈관 건강의 잘 이해되지 않고 충분히 연구되지 않은 영역이다30. 산화 스트레스와 혈전 상태를 연결하는 분자 메커니즘에 대한 이해가 제한적임에도 불구하고 심혈관 질환에 대한 보호를 위한 항산화제의 임상적 관련성은 상당한 주목을 받았습니다. 혈장 항산화제 수치는 심혈관 질환 발병 위험과 반비례하는 것으로 나타났으며, 식이 항산화제 섭취는 관상 동맥 질환을 예방하는 것으로 나타났습니다31,32. 결과적으로, 식이 항산화제의 사용은 심혈관 질환 예방을 위한 유망한 접근법으로 옹호되어 왔습니다 33,34,35. 혈소판에서 ROS 생성의 영향 중에서, 세포사멸의 증가는 중요한 병태생리학적 영향을 미칠 수 있다36,37. 전반적으로, 혈소판에 의한 O2•- 출력을 검출하고 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜은 심혈관 연구에서 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다.

현재 ROS 검출에 사용 가능한 기술은 특이성(즉, 검출된 산화제 분자의 화학적 특성은 알려지지 않음) 및 신뢰성(즉, 생물학적 분자 및 실험 시약과의 원치 않는 상호 작용이 편향된 비생리학적 결과로 이어짐)의 중요한 한계가 있습니다38,39. 혈소판에서 ROS를 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 접근법은 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)의 사용을 기반으로 하며, 이는 세포 내 에스테라아제에 의해 디클로로디하이드로플루오레세인(DCFH)으로 전환되고 결과적으로 하이드록실 라디칼 및 과산화효소-H2O2중간체를 포함한 세포 산화제에 의해 고형광 디클로로플루오레세인(DCF)으로 전환됩니다(40,41). 광범위한 사용에도 불구하고 세포 내 ROS38 측정을 위한 이 접근법의 신뢰성에 대해 심각한 의문이 제기되었습니다. DCFH에서 DCF로의 산화는 실제로 ROS42 대신 전이 금속 이온(예: Fe2+) 또는 헴 함유 효소(예: 시토크롬)에 의해 유도될 수 있습니다. 더욱이, DCFDA는 세포 과산화효소에 의해 세미퀴논 자유 라디칼 형태(DCF•-)로 전환되고, 이는 다시 분자 산소(O2)와O2•-의 방출과 함께 DCF로 산화되어 산화 반응의 인위적 증폭으로 이어진다 41,43,44. 따라서, DCFDA에 의한 세포내 ROS의 검출은 초기 통찰력을 얻는 데 유용하지만, 신중한 고려와 광범위한 실험적 통제가 필요하다38,39.

이 연구는 혈소판 기능 O2 • -1의 주요 조절자의 검출 및 측정을위한 세 가지 대체 기술을 제시합니다. 첫 번째 기법은 DHE와 유세포 분석을 사용한 검출로, DCFDA에 비해 신뢰성과 특이성의 이점을 제공합니다. 여기에서 제안하는 두 번째 기술도 DHE를 사용하지만 검출 방법은 실시간 혈소판 형광 이미징으로, 빠른 역학 및 단일 세포 분해능으로 혈소판 신호 전달 시 O2•-의 생성을 연구할 수 있습니다. 마지막으로, EPR 공명 실험에서 하이드록실아민 스핀 프로브 1-하이드록시-3-메톡시카르보닐-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘(CMH)의 사용을 기반으로 하는 프로토콜은 혈소판에 의한O2•- 생성 속도를 정량화하고 다른 조건에서 비교할 수 있는 가능성을 제공합니다.

프로토콜

동의한 지원자의 말초 혈액 수집은 지역 윤리 위원회와 National Health Service Health Research Authority의 승인을 받습니다(REC 참조: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. 방법 1: 유세포 분석에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

  1. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  2. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  3. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  4. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  5. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid(HEPES), 1mM MgCl2, 5mM glucose, pH 7.3)(37°C)에 2 x 108 혈소판/mL의 밀도로 재현탁합니다.
  6. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  7. 5mM의 스톡 농도에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 DHE를 준비합니다.
  8. 5 μM 최종 농도에서 혈소판 현탁액에 DHE를 첨가하고(원액을 1-1,000으로 희석, 최종 DMSO 농도 0.1% v/v) 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  9. 원하는 생리적 자극과 농도(예: 0.1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)로 자극하기 전에 약리제수 및/또는 ROS 제거제로 혈소판을 치료합니다.
  10. 자극 후, 얼음처럼 차가운 변형 HEPES 완충액에 혈소판 현탁액 1-10을 희석합니다.
  11. 유세포 분석의 경우 측면 산란(SSC) 및 전방 산란(FSC) 이득을 각각 40mV 및 220mV로 설정하고 로그 스케일 산점도를 사용하여 현탁액의 입자 집단을 시각화합니다( 그림 1A의 예).
  12. (선택 사항) 항-CD41 항체를 사용하여 혈소판 현탁액의 1개 분취액을 면역염색하여 혈소판에 해당하는 사건 집단을 식별합니다(예: 그림 1B).
  13. 405nm(보라색 레이저)에서의 여기와 580nm 파장의 방출을 사용하여 유세포 분석으로 시료를 분석하며, 이를 통해 과산화물 음이온 특이적 산물인 2-hydroxy-ethidium(2OH-Et+)을 선택적으로 검출할 수 있습니다(그림 2).
    참고: 파라포름알데히드에 고정하고 장기간 샘플을 보관하는 것은 권장되지 않습니다.

2. 방법 2: 단일 혈소판 형광 이미징에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

  1. 실험 당일 8웰 μ슬라이드에 말 힘줄(Horm collagen)의 0.1mg/mL fibrillar collagen I, 0.2mg/mL fibrinogen 또는 1mg/mL poly-L-lysine(PLL)을 변형된 Tyrode의 완충액에 37°C에서 2시간 동안 코팅합니다.
  2. 변형된 Tyrode의 버퍼로 두 번 세척합니다(각 10분).
  3. 변형된 Tyrode의 완충액과 5mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)을 최소 30분 동안(또는 실험 때까지) 배양하여 비특이적 접착을 퀜칭합니다.
  4. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  5. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  6. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  7. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  8. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 5mM 포도당, pH 7.3)(37°C)에 4 x 107 혈소판/mL의 밀도로 재현탁시킵니다.
  9. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  10. 10mM의 스톡 농도에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 DHE를 준비합니다.
  11. 혈소판 현탁액에 10μM 최종 농도의 DHE를 첨가하고(원액을 1-1,000으로 희석하고 최종 DMSO 농도 0.1% v/v) 1분(37°C) 동안 배양합니다.
  12. DHE로 1분 배양한 후 선택한 웰에서 차단 용액을 제거하고 μ-슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 이미징 준비를 한 다음 혈소판을 부드럽게 분배합니다.
  13. 10분(405/580nm ex/em) 동안 역 컨포칼 이미징을 통해 DHE를 2OH-Et+로 변환하는 것을 모니터링하고 40x 오일 이멀젼 렌즈로 10초마다 이미지를 수집합니다.
  14. (선택 사항) PLL로 코팅된 웰의 경우, 2.13단계에 설명된 대로 혈소판 분주 및 형광 이미지 수집 10분 후에 작용제를 추가하여 가용성 작용제(예: 0.1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)에 대한 반응으로 과산화물 음이온 생성을 모니터링합니다.
  15. (선택 사항) 필요한 경우 시간 경과 동안 웰 측면에 부드럽게 분주하여 과산화물 음이온 제거제 또는 선택적 억제제(예: NOX 억제제)를 추가하고 2.13에 설명된 대로 추가로 10분 동안 형광 이미지를 수집합니다.
  16. 대표적인 단일 혈소판을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하고 이미징 제품군 ImageJ 1.53t의 측정 도구를 사용하여 다양한 프레임에서 형광 강도를 분석하여 단일 세포 형광 분석을 정량화합니다.

3. 방법 3: 전자 상자성 공명(EPR)을 이용한 혈소판에 의한 과산화물 음이온 검출

  1. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  2. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  3. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  4. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  5. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 5mM 포도당, pH 7.3)(37°C)에 2 x 108 혈소판/mL의 밀도로 재현탁시킵니다.
  6. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  7. 혈소판 현탁액에 5μM 디에틸디티오카르바메이트(DETC)와 25μM 데페록사민을 추가합니다.
  8. 배양하지 않고 200μM 1-하이드록시-3-메톡시카르보닐-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘(CMH)을 추가합니다.
  9. 응집 큐벳(테프론 코팅된 교반 자석 포함) 내의 응집계에 샘플을 로드합니다.
  10. 1분 후 원하는 농도(예: 1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)로 자극을 추가합니다. 10분 동안 배양합니다.
  11. (선택 사항) 원하는 시간에 3.12 단계로 진행하여 다른 시점에서 과산화물 음이온 생성을 얻습니다.
  12. 혈소판 현탁액을 응집 큐벳에서 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10초 동안 6,000 x g 에서 빠르게 스핀다운합니다.
  13. 모세관 마이크로피펫에 50μL의 상층액을 로드하고 EPR 밀봉 왁스로 밀봉합니다.
  14. 샘플을 EPR 스캐너로 이송합니다.
  15. EPR 스캐너를 다음과 같이 설정합니다: 중심 필드 3,492.5G, 필드 스윕 60G, 변조 진폭 2G, 스윕 시간 10초, 스캔 수 10, 마이크로파 주파수 9.39GHz, 마이크로파 전력 20mW, 변환 시간 327.68ms, 시간 상수 5242.88ms.
  16. 위의 매개변수를 사용하여 기록된 EPR 피크의 곡선 아래 면적(AUC)으로 CM● 에 대한 CMH 산화를 추정합니다.
  17. 단계 3.16에서 설명한 대로 측정된 EPR 강도를 y축에서 플로팅하고 x축에서 상업적으로 이용 가능한 CM● 의 농도(예: 0, 0.3, 1, 3, 10 및 30μM)를 플로팅하는 보정 곡선을 만듭니다.
  18. 샘플의 CM● 농도에서 대표 결과 섹션에 설명된 공식을 사용하여 샘플의 혈소판에 의해 생성된 과산화물 음이온의 양을 얻습니다.

결과

DHE 형광의 유세포 분석 검출을 위해 휴지 상태(그림 3A) 또는 0.1 unit/mL 트롬빈으로 자극된 혈소판(그림 3B)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. O2•- 출력은 0.1 unit/mL 트롬빈(그림 3C) 또는 3μg/mL 콜라겐 관련 펩타이드(CRP)를 사용한 자극에 대해 표시된 바와 같이 혈소판 평균 형광 ?...

토론

이 원고에서는 O2•-의 선택적 검출을 통해 혈소판 기능의 산화 환원 의존성 조절을 조사할 수 있는 능력을 향상시킬 수 있는 세 가지 다른 기술을 제시합니다. 처음 두 가지 방법은 산화 환원 프로브가 사용되었기 때문에 기존 기술을 개선한 것입니다(더 일반적이지만 덜 신뢰할 수 있는 DCFDA 대신 DHE). 따라서 이러한 기술은 쉽게 접근할 수 있으며...

공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 영국 심장 재단(PG/15/40/31522), 영국 알츠하이머 연구(ARUK-PG2017A-3) 및 유럽 연구 위원회(#10102507)의 지원으로 G. Pula에 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

참고문헌

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