혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

요약

과산화물 음이온의 생성은 혈소판의 자극에 필수적이며, 조절이 잘 되지 않는 경우 혈전성 질환에 매우 중요합니다. 여기에서는 과산화물 음이온의 선택적 검출과 산화 환원 의존성 혈소판 조절 연구를 위한 세 가지 프로토콜을 제시합니다.

초록

활성 산소종(ROS)은 매우 불안정한 산소 함유 분자입니다. 화학적 불안정성으로 인해 반응성이 매우 높고 단백질, 핵산 및 지질과 같은 중요한 생물학적 분자와 반응할 수 있는 능력을 제공합니다. 과산화물 음이온은 분자 산소 환원의 감소(즉, 하나의 전자 획득)에 의해 생성되는 중요한 ROS입니다. 초기에는 노화, 퇴행성 및 병원성 과정에만 영향을 미쳤지만, 중요한 생리적 반응에 대한 참여가 최근에 명백해졌습니다. 혈관 시스템에서 과산화물 음이온은 혈관 평활근 세포의 분화 및 기능, 혈관 신생에서 혈관 내피 세포의 증식 및 이동, 면역 반응 및 지혈에서 혈소판의 활성화를 조절하는 것으로 나타났습니다. 과산화물 음이온의 역할은 혈소판의 조절 장애와 암, 감염, 염증, 당뇨병 및 비만을 포함한 다양한 상태와 관련된 심혈관 합병증에 특히 중요합니다. 따라서 인간 혈소판에 의한 과산화물 음이온의 생성을 효과적으로 측정하고, 지혈과 혈전증 사이의 균형을 조절하는 산화 환원 의존 메커니즘을 이해하고, 궁극적으로 혈전증 및 심혈관 합병증으로 이어지는 혈소판 반응의 조절을 위한 새로운 약리학적 도구를 식별할 수 있는 것이 심혈관 연구에서 매우 중요해졌습니다. 이 연구는 혈소판에서 과산화물 음이온을 검출하고 지혈 및 혈전증을 조절하는 산화 환원 의존성 메커니즘에 대한 연구를 위해 성공적으로 채택된 세 가지 실험 프로토콜을 제시합니다: 1) 유세포 분석에 의한 디하이드로에티듐(DHE) 기반 과산화물 음이온 검출; 2) 단일 혈소판 이미징에 의한 DHE 기반 과산화물 음이온 시각화 및 분석; 3) 전자 상자성 공명(EPR)에 의한 혈소판의 과산화물 음이온 출력의 스핀 프로브 기반 정량화.

서문

과산화물 음이온(_O2^•-)은 혈^소판1에서 생성된 가장 기능적으로 관련성이 높은 ROS이다. O₂ ^{• -}는 분자 산소의 환원의 산물이며 많은 다른 ROS ^{2 의} 전구체입니다. O₂ ^{• -}의 변이는 수용액에서의 자발적 반응 또는 과산화물 이산 효소 (SOD³ )에 의해 촉매 된 반응을 통해 과산화수소 (H₂O₂ )의 생성으로 이어집니다. 다양한 효소 공급원이 제안되었지만(예: 크산틴 산화효소⁴, 리폭시게나제⁵, 사이클로옥시게나제^{6 및} 산화질소 합성효소⁷), 미토콘드리아 호흡 ^8,9 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 산화효소(NOX)

프로토콜

동의한 지원자의 말초 혈액 수집은 지역 윤리 위원회와 National Health Service Health Research Authority의 승인을 받습니다(REC 참조: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. 방법 1: 유세포 분석에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

1. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
2. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
3. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
4. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
5. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1....

토론

이 원고에서는 O₂^•-의 선택적 검출을 통해 혈소판 기능의 산화 환원 의존성 조절을 조사할 수 있는 능력을 향상시킬 수 있는 세 가지 다른 기술을 제시합니다. 처음 두 가지 방법은 산화 환원 프로브가 사용되었기 때문에 기존 기술을 개선한 것입니다(더 일반적이지만 덜 신뢰할 수 있는 DCFDA 대신 DHE). 따라서 이러한 기술은 쉽게 접근할 수 있으며.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope