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要約

スーパーオキシドアニオンの生成は、血小板の刺激に不可欠であり、調節不全の場合、血栓性疾患にとって重要です。ここでは、スーパーオキシドアニオンの選択的検出と酸化還元依存性血小板調節の研究のための3つのプロトコルを紹介します。

要約

活性酸素種(ROS)は、非常に不安定な酸素含有分子です。化学的に不安定であるため、非常に反応性が高く、タンパク質、核酸、脂質などの重要な生体分子と反応する能力があります。スーパーオキシドアニオンは、分子状酸素の還元(すなわち、1つの電子の獲得)によって生成される重要なROSです。最初は老化、変性、および病原性のプロセスにのみ関与しているにもかかわらず、最近、重要な生理学的応答への関与が明らかになりました。血管系では、スーパーオキシドアニオンが血管平滑筋細胞の分化と機能、血管新生における血管内皮細胞の増殖と移動、免疫応答、および止血における血小板の活性化を調節することが示されています。スーパーオキシドアニオンの役割は、血小板の調節不全や、がん、感染症、炎症、糖尿病、肥満など、さまざまな症状に関連する心血管合併症において特に重要です。したがって、ヒト血小板によるスーパーオキシドアニオンの生成を効果的に測定し、止血と血栓症のバランスを調節する酸化還元依存性メカニズムを理解し、最終的には血栓症や心血管合併症につながる血小板応答の調節のための新しい薬理学的ツールを特定できることは、心血管研究において非常に重要になっています。この研究では、血小板中のスーパーオキシドアニオンの検出と、止血と血栓症を調節する酸化還元依存性メカニズムの研究に成功した3つの実験プロトコルを紹介します:1)フローサイトメトリーによるジヒドロエチジウム(DHE)ベースのスーパーオキシドアニオン検出。2)DHEベースのスーパーオキシドアニオンの可視化と単一血小板イメージングによる分析。3)電子常磁性共鳴(ESR)による血小板中のスーパーオキシドアニオン出力のスピンプローブベースの定量化。

概要

スーパーオキシドアニオン(O2•-)は、血小板1で生成される最も機能的に関連性のあるROSです。O2•-は、分子状酸素の還元と多くの異なるROS 2の前駆体の産物です。O2•-の不整化は、水溶液中での自発的な反応またはスーパーオキシドジスムターゼ(SODs3)によって触媒される反応を介して過酸化水素(H 2 O2)の生成につながります。キサンチンオキシダーゼ4、リポキシゲナーゼ5、シクロオキシゲナーゼ6、一酸化窒素シンターゼ7など、さまざまな酵素源が提案されていますが、ミトコンドリア呼吸8,9およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ(NOX)10は、真核細胞におけるスーパーオキシドアニオンの最も顕著な供給源です。これは血小板にも当てはまるようで、ミトコンドリア呼吸からの電子漏れ11,12とNOXの酵素活性13,14がスーパーオキシドアニオン出力の主な寄与者として説明されています。

いくつかの研究はO2•-による血小板の調節に焦点を当てていますが、原因となる分子メカニズムについてはコンセンサスがありません。直接酸化とジスルフィド結合形成による表面受容体活性の調節は、さまざまな血小板受容体に対して提案されています。システイン残基の直接酸化によるROSによるインテグリンαIIbβ3の正の調節が示唆されています15,16,17。同様に、コラーゲンに対する血小板応答は、ジスルフィド依存性二量体化とそれに伴う糖タンパク質VI(GPVI)の二量体化18に依存するため、実験的に完全に証明されていないが、ROS依存性酸化による受容体活性増強が提案されている19。最後に、ROSによる糖タンパク質Ib(GPIb)のスルフヒドリル基の酸化は、炎症中の血小板接着と血小板-白血球相互作用を促進することが示されました20。逆に、スルフヒドリル基の酸化および受容体活性化の減少の結果として考えられるものとして、GPVIおよびGPIbの両方のエクトドメインの脱落は、条件21を減少させることによって減少する。

血小板表面受容体の直接酸化とは無関係の作用機序も提案されています。ROSは、O2•-を含み、Srcホモロジー領域2含有タンパク質チロシンホスファターゼ2(SHP-2)の活性を弱めることにより、コラーゲン受容体GPVIを正に調節することが示されています。これは、この受容体22のシグナル伝達カスケードを負に調節します。さらに、O2•-は、通常はNO感受性グアニルシクラーゼ(NO-GC)を介して血小板を阻害する一酸化窒素(NO)との迅速な反応と、負の血小板調節因子サイクリックGMP(cGMP)の生成により、ONOO-(ペルオキシ亜硝酸塩)を生成することができます23,24。その結果、NOレベルが低下すると、血小板の増強につながる可能性があります。あるいは、NOX2によるO2•-の生成は、血小板の活性化と接着に必須の脂質過酸化とイソプロスタン形成に寄与することが示唆されている25。最後に、血小板26の酸化還元ストレスセンサーとして提案されたプロテインキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の細胞外シグナル調節キナーゼ5(ERK5)は、O2•-によって活性化され、血小板の凝固促進表現型を誘導する(フローサイトメトリーに基づくホスファチジルセリンの外部化測定によって推定される)27。

血小板におけるO2•-および他のROS生成の調節不全は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、肥満、および癌に関連する血栓性心血管合併症につながる誇張された止血反応と関連しています28,29。これらの病理学的設定では、血小板によるROS出力が増加し、それがそれらの接着性および凝集性応答の増強につながります。血小板反応への影響に加えて、血小板のフリーラジカル出力は、他の血液細胞や血管構造に影響を与える可能性があり、これは心血管の健康の十分に理解されておらず、十分に調査されていない領域です30。酸化ストレスと血栓性疾患を結びつける分子メカニズムについての理解は限られていますが、抗酸化物質が心血管疾患に対する防御に臨床的に関連性があることは、かなりの注目を集めています。血漿抗酸化物質のレベルは、心血管疾患を発症するリスクと逆相関することが示されており、食事による抗酸化物質の摂取は冠状動脈疾患から保護することが示されています31,32。その結果、食事性抗酸化物質の使用は、心血管疾患予防の有望なアプローチとして提唱されてきました33,34,35。血小板でのROS生成の影響の中で、アポトーシスの増加は重要な病態生理学的影響を及ぼし得る36,37。全体として、血小板によるO2•-出力を検出および定量するための信頼性の高いプロトコルは、心血管研究においてますます重要性が高まっています。

現在、ROSの検出に利用可能な技術には、特異性(すなわち、検出された酸化分子の化学的性質が不明)および信頼性(すなわち、生体分子および実験試薬との望ましくない相互作用が偏った非生理学的結果につながる)の重要な制限がある38,39。血小板中のROSの検出に最も一般的に使用されるアプローチは、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFDA)の使用に基づいており、これは細胞内エステラーゼによってジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)に変換され、その結果、ヒドロキシルラジカルおよびペルオキシダーゼ-H2O2中間体40,41を含む細胞酸化剤によって高蛍光ジクロロフルオレセイン(DCF)に変換されます.その広範な使用にもかかわらず、細胞内ROSの測定のためのこのアプローチの信頼性に関して深刻な疑問が提起されています38。DCFHのDCFへの酸化は、実際には、ROS42の代わりに遷移金属イオン(Fe2+など)またはヘム含有酵素(シトクロムなど)によって誘導される可能性があります。さらに、DCFDAは、細胞ペルオキシダーゼによってそのセミキノンフリーラジカル型(DCF•-)に変換され、それが次に分子状酸素(O2)との反応によりDCFに酸化され、O2•-が放出され、酸化応答の人工的な増幅につながる41,43,44.したがって、DCFDAによる細胞内ROSの検出は、初期の洞察を得るのに有用であるが、慎重な検討と広範な実験的制御が必要である38,39。

この研究では、血小板機能O2•-1の主要な調節因子の検出と測定のための3つの代替技術を紹介します。最初の手法は、DHEとフローサイトメトリーを使用した検出であり、DCFDAよりも信頼性と特異性に利点があります。ここで提案されている2つ目の手法もDHEを利用していますが、検出方法は生血小板蛍光イメージングであり、血小板シグナル伝達によるO2•-の生成を高速な速度論と単一細胞分解能で研究することができます。最後に、ESR共鳴実験におけるヒドロキシアミンスピンプローブ1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン(CMH)の使用に基づくプロトコルは、血小板によるO2•- 生成の速度を定量化し、異なる条件で比較する可能性を提供します。

プロトコル

同意したボランティアからの末梢血の採取は、地元の倫理委員会と国民保健サービス保健研究局によって承認されています(REC参照:21 / SC / 0215;IRAS ID: 283854).

1. 方法1:フローサイトメトリーによるDHEを用いたスーパーオキシドアニオン検出

  1. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  2. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  3. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  4. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  5. 得られた血小板ペレットを、2 x 108 platelets/mL の密度で、修飾チロード緩衝液 (145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3) (37 °C) に再懸濁します。
  6. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  7. ジメチルスルホキシド(DMSO)にDHEをストック濃度5 mMで調製します。
  8. 最終濃度5 μMで血小板懸濁液にDHEを添加し(ストック溶液を1〜1,000に希釈し、最終DMSO濃度0.1% v/v)、37°Cで15分間インキュベートします。
  9. 刺激の15分間前に、血小板を薬理学的薬剤および/またはROSスカベンジャーで処理し、目的の生理学的刺激と濃度(例:.、0.1ユニット/ mLトロンビンまたは3μg/ mLコラーゲン)。.
  10. 刺激後、血小板懸濁液1〜10を氷冷改変HEPES緩衝液で希釈します。
  11. フローサイトメトリーでは、側方散乱(SSC)と前方散乱(FSC)のゲインをそれぞれ40 mVと220 mVに設定し、対数スケールの散布図を使用して懸濁液中の粒子集団を可視化します( 図1Aの例)。
  12. (オプション)抗CD41抗体を使用して血小板懸濁液の1アリコートを免疫染色し、血小板に対応するイベントの集団を同定します( 図1Bの例)。
  13. 405 nmの励起(紫色レーザー)と580 nmの波長での発光を使用してフローサイトメトリーでサンプルを分析し、スーパーオキシドアニオン特異的生成物である2-ヒドロキシ-エチジウム(2OH-Et+)を選択的に検出します(図2)。
    注:パラホルムアルデヒドによる固定およびサンプルの長期保存はお勧めできません。

2. 方法2:DHEを用いたスーパーオキシドアニオン検出、単板蛍光イメージング

  1. 実験当日に、ウマ腱由来の0.1 mg/mLフィブリルコラーゲンI(ホルムコラーゲン)、0.2 mg/mLフィブリノーゲン、または1 mg/mLポリ-L-リジン(PLL)を修飾チロード緩衝液中で8ウェルμスライドに37°Cで2時間塗布します。
  2. 改質タイロード緩衝液で2回洗浄します(各10分)。
  3. 非特異的接着をクエンチするには、修飾チロード緩衝液と5 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を最低30分間(または実験まで)インキュベートします。
  4. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  5. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  6. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  7. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  8. 得られた血小板ペレットを改変チロード緩衝液(145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3)(37°C)に4 x 107 血小板/mLの密度で再懸濁します。
  9. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  10. ジメチルスルホキシド(DMSO)にDHEをストック濃度10 mMで調製します。
  11. 最終濃度10 μMのDHEを血小板懸濁液に添加し(ストック溶液を1:1,000に希釈し、最終DMSO濃度0.1% v/v)、1分間(37°C)インキュベートします。
  12. DHEとの1分間のインキュベーション後、選択したウェルからブロッキング溶液を取り出し、イメージングの準備が整った顕微鏡ステージにμスライドを配置し、血小板を穏やかに分注します。
  13. 40倍油浸レンズで10秒ごとに画像を収集し、10分間(405/580 nm ex/em)の逆共焦点イメージングにより、DHEの2OH-Et+への変換を監視します。
  14. (オプション)PLLでコーティングされたウェルの場合、水溶性アゴニスト(0.1 unit/mLトロンビンまたは3 μg/mLコラーゲンなど)に応答するスーパーオキシドアニオン生成をモニタリングし、ステップ2.13で説明したように、血小板分注の10分後にアゴニストを添加し、さらに10分間蛍光画像収集を行います。
  15. (オプション)必要に応じて、スーパーオキシドアニオンスカベンジャーまたは選択的阻害剤(NOX阻害剤など)を、時間経過中にウェルの側面に穏やかに分注して追加し、2.13に記載されているようにさらに10分間蛍光画像を収集します。
  16. 代表的な単一血小板を含む 関心領域(ROI) を選択し、イメージングスイートImageJ 1.53t の測定ツールを使用して異なる フレームの蛍光強度を分析することにより、シングルセル蛍光分析を定量化します。

3. 方法3:電子常磁性共鳴(ESR)を用いた血小板によるスーパーオキシドアニオンの検出

  1. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  2. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  3. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  4. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  5. 得られた血小板ペレットを改変型チロード緩衝液(145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3)(37 °C)に2 x 108 血小板/mLの密度で再懸濁します。
  6. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  7. 5 μM ジエチルジチオカルバメート (DETC) と 25 μM デフェロキサミンを血小板懸濁液に加えます。
  8. インキュベーションせずに、200 μM 1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン(CMH)を添加します。
  9. アグリゲーションキュベット(テフロンコーティングされた攪拌磁石を含む)内のアグリゴメーターにサンプルをロードします。
  10. 1分後、目的の濃度で刺激を加えます(例:1ユニット/mLトロンビンまたは3μg/mLコラーゲン)。10分間インキュベートします。
  11. (オプション)異なる時点でのスーパーオキシドアニオン生成を得るには、目的の時間にステップ3.12に進みます。
  12. 血小板懸濁液を凝集キュベットから微量遠心チューブに移し、6,000 x g で10秒間迅速にスピンダウンします。
  13. 上清50μLをキャピラリーマイクロピペットにロードし、ESRシーリングワックスでシールします。
  14. サンプルをESRスキャナーに移します。
  15. ESRスキャナーを次のように設定します:センターフィールド3,492.5 G、フィールドスイープ60 G、変調振幅2 G、スイープ時間10秒、スキャン数10、マイクロ波周波数9.39 GHz、マイクロ波電力20 mW、変換時間327.68 ms、時定数5242.88 ms。
  16. 上記のパラメータを使用して、記録された ESR ピークの曲線下面積 (AUC) として CMH 酸化を CM● に推定します。
  17. ステップ 3.16 で測定した ESR 強度を Y 軸に、市販の CM● の濃度を X 軸にプロットする検量線を作成します (例: 0、0.3、1、3、10、30 μM)。
  18. 試料中のCM● 濃度から、試料中の血小板が生成するスーパーオキシドアニオンの量を、代表結果セクションに記載の式を用いて求めます。

結果

DHE蛍光のフローサイトメトリー検出では、休止状態(図3A)または0.1ユニット/mLトロンビンで刺激した血小板(図3B)の代表的な結果を示します。O2•- 出力は、0.1 unit/mLトロンビン(図3C)または3 μg/mLコラーゲン関連ペプチド(CRP)(図3D)による刺激で示されている?...

ディスカッション

この論文では、O2•-の選択的検出を介して血小板機能の酸化還元依存性調節を調査する能力を進歩させる可能性のある3つの異なる手法を紹介します。最初の 2 つの方法は、使用される酸化還元プローブ (より一般的であるが信頼性が低い DCFDA の代わりに DHE を使用する) により、既存の手法を改良したものです。したがって、これらの技術は?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、英国心臓財団(PG/15/40/31522)、アルツハイマー研究英国(ARUK-PG2017A-3)、および欧州研究会議(#10102507)のG.プーラへの助成金によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

参考文献

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