血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法

要約

スーパーオキシドアニオンの生成は、血小板の刺激に不可欠であり、調節不全の場合、血栓性疾患にとって重要です。ここでは、スーパーオキシドアニオンの選択的検出と酸化還元依存性血小板調節の研究のための3つのプロトコルを紹介します。

要約

活性酸素種(ROS)は、非常に不安定な酸素含有分子です。化学的に不安定であるため、非常に反応性が高く、タンパク質、核酸、脂質などの重要な生体分子と反応する能力があります。スーパーオキシドアニオンは、分子状酸素の還元(すなわち、1つの電子の獲得)によって生成される重要なROSです。最初は老化、変性、および病原性のプロセスにのみ関与しているにもかかわらず、最近、重要な生理学的応答への関与が明らかになりました。血管系では、スーパーオキシドアニオンが血管平滑筋細胞の分化と機能、血管新生における血管内皮細胞の増殖と移動、免疫応答、および止血における血小板の活性化を調節することが示されています。スーパーオキシドアニオンの役割は、血小板の調節不全や、がん、感染症、炎症、糖尿病、肥満など、さまざまな症状に関連する心血管合併症において特に重要です。したがって、ヒト血小板によるスーパーオキシドアニオンの生成を効果的に測定し、止血と血栓症のバランスを調節する酸化還元依存性メカニズムを理解し、最終的には血栓症や心血管合併症につながる血小板応答の調節のための新しい薬理学的ツールを特定できることは、心血管研究において非常に重要になっています。この研究では、血小板中のスーパーオキシドアニオンの検出と、止血と血栓症を調節する酸化還元依存性メカニズムの研究に成功した3つの実験プロトコルを紹介します:1)フローサイトメトリーによるジヒドロエチジウム(DHE)ベースのスーパーオキシドアニオン検出。2)DHEベースのスーパーオキシドアニオンの可視化と単一血小板イメージングによる分析。3)電子常磁性共鳴(ESR)による血小板中のスーパーオキシドアニオン出力のスピンプローブベースの定量化。

概要

スーパーオキシドアニオン(O₂^•-)は、血小板¹で生成される最も機能的に関連性のあるROSです。O₂^•-は、分子状酸素の還元と多くの異なるROS ²の前駆体の産物です。O₂^•-の不整化は、水溶液中での自発的な反応またはスーパーオキシドジスムターゼ(^SODs3)によって触媒される反応を介して過酸化水素(H 2 O₂)の生成につながります。キサンチンオキシダーゼ⁴、リポキシゲナーゼ⁵、シクロオキシゲナーゼ^6、一酸化窒素シンターゼ⁷など、さまざまな酵素源が提案されていますが、ミトコンドリア呼吸^8,9およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ(NOX)¹⁰は、真核細胞....

プロトコル

同意したボランティアからの末梢血の採取は、地元の倫理委員会と国民保健サービス保健研究局によって承認されています(REC参照:21 / SC / 0215;IRAS ID: 283854).

1. 方法1:フローサイトメトリーによるDHEを用いたスーパーオキシドアニオン検出

1. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
2. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
3. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
4. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
5. 得られた血小板ペレットを、2 x 10⁸ platelets/mL の密度で、修飾チロード緩衝液 (145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、1 mM MgCl2、5 mM グルコ....

結果

DHE蛍光のフローサイトメトリー検出では、休止状態(図3A)または0.1ユニット/mLトロンビンで刺激した血小板(図3B)の代表的な結果を示します。O₂^•- 出力は、0.1 unit/mLトロンビン(図3C)または3 μg/mLコラーゲン関連ペプチド(CRP)(図3D)による刺激で示されている?.......

ディスカッション

この論文では、O₂^•-の選択的検出を介して血小板機能の酸化還元依存性調節を調査する能力を進歩させる可能性のある3つの異なる手法を紹介します。最初の 2 つの方法は、使用される酸化還元プローブ (より一般的であるが信頼性が低い DCFDA の代わりに DHE を使用する) により、既存の手法を改良したものです。したがって、これらの技術は?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope