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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La génération d’anions superoxydes est essentielle pour la stimulation des plaquettes et, si elle est dérégulée, critique pour les maladies thrombotiques. Nous présentons ici trois protocoles pour la détection sélective des anions superoxyde et l’étude de la régulation plaquettaire dépendante de l’oxydoréduction.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules contenant de l’oxygène très instables. Leur instabilité chimique les rend extrêmement réactifs et leur donne la capacité de réagir avec des molécules biologiques importantes telles que les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Les anions superoxydes sont des ROS importants générés par la réduction de la réduction moléculaire de l’oxygène (c’est-à-dire l’acquisition d’un électron). Malgré leur implication initiale exclusivement dans le vieillissement, les processus dégénératifs et pathogènes, leur participation à d’importantes réponses physiologiques est récemment devenue apparente. Dans le système vasculaire, il a été démontré que les anions superoxydes modulent la différenciation et la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires, la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires dans l’angiogenèse, la réponse immunitaire et l’activation des plaquettes dans l’hémostase. Le rôle des anions superoxydes est particulièrement important dans la dérégulation des plaquettes et les complications cardiovasculaires associées à une pléthore de conditions, notamment le cancer, les infections, l’inflammation, le diabète et l’obésité. Il est donc devenu extrêmement pertinent dans la recherche cardiovasculaire de pouvoir mesurer efficacement la génération d’anions superoxydes par les plaquettes humaines, de comprendre les mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’équilibre entre l’hémostase et la thrombose et, éventuellement, d’identifier de nouveaux outils pharmacologiques pour la modulation des réponses plaquettaires conduisant à la thrombose et aux complications cardiovasculaires. Cette étude présente trois protocoles expérimentaux adoptés avec succès pour la détection des anions superoxydes dans les plaquettes et l’étude des mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’hémostase et la thrombose : 1) détection d’anions superoxydes à base de dihydroéthidium (DHE) par cytométrie en flux ; 2) visualisation et analyse des anions superoxydes à base de DHE par imagerie plaquettaire unique ; et 3) la quantification par sonde de spin de la production d’anions superoxydes dans les plaquettes par résonance paramagnétique électronique (EPR).

Introduction

L’anion superoxyde (O2•-) est le ROS le plus pertinent sur le plan fonctionnel généré dans les plaquettes1. O2•- est le produit de la réduction de l’oxygène moléculaire et le précurseur de nombreux ROS 2 différents. La dismutation de O2•- conduit à la génération de peroxyde d’hydrogène (H2O2) par des réactions spontanées en solution aqueuse ou des réactions catalysées par des superoxydes dismutases (SODs3). Bien que différentes sources enzymatiques aient été suggérées (par exemple, la xanthine oxydase4, la lipoxygénase5, la cyclooxygénase6 et l’oxyde nitrique synthase7), la respiration mitochondriale 8,9 et les nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxydases (NOXs)10 sont les sources les plus importantes d’anion superoxyde dans les cellules eucaryotes. Cela semble également être le cas dans les plaquettes, où la fuite d’électrons de la respiration mitochondriale11,12 et l’activité enzymatique des NOX13,14 ont été décrites comme les principaux contributeurs à la production d’anions superoxydes.

Bien que plusieurs études se soient intéressées à la régulation des plaquettes par l’O2•-, il n’y a pas de consensus sur les mécanismes moléculaires responsables. La modulation de l’activité des récepteurs de surface via l’oxydation directe et la formation de liaisons disulfure a été proposée pour différents récepteurs plaquettaires. La régulation positive de l’intégrine αIIbβ3 par les ROS via l’oxydation directe des résidus de cystéine a été suggérée 15,16,17. De même, étant donné que les réponses plaquettaires au collagène dépendent de la dimérisation dépendante du disulfure et de la dimérisation conséquente de la glycoprotéine VI (GPVI)18, la potentialisation de l’activité du récepteur par oxydation dépendante des ROS a été proposée19, bien que non entièrement prouvée expérimentalement. Enfin, il a été démontré que l’oxydation induite par les ROS des groupes sulfhydryles de la glycoprotéine Ib (GPIb) favorise l’adhésion plaquettaire et l’interaction plaquettes-leucocytes pendant l’inflammation20. Inversement, comme conséquence possible de la diminution de l’oxydation du groupe sulfhydryle et de l’activation des récepteurs, l’élimination de l’ectodomaine de GPVI et GPIb est diminuée par les conditions réductrices21.

Des modes d’action indépendants d’une oxydation directe des récepteurs de surface plaquettaire ont également été proposés. Il a été démontré que les ROS, y compris l’O2•-, modulent positivement le récepteur de collagène GPVI en atténuant l’activité de la protéine tyrosine phosphatase 2 (SHP-2), qui régule négativement la cascade de signalisation de ce récepteur22. De plus, l’O2•- peut générer de l’ONOO- (peroxynitrite) par réaction rapide avec l’oxyde nitrique (NO), qui inhibe normalement les plaquettes par l’intermédiaire de la guanylyl cyclase sensible au NO (NO-GC) et la génération du régulateur plaquettaire négatif GMP cyclique (GMPc)23,24. La diminution des niveaux de NO qui en résulte peut entraîner une potentialisation plaquettaire. Par ailleurs, il a été suggéré que la génération d’O2•- par NOX2 contribue à la peroxydation lipidique et à la formation d’isoprostane, ce qui est essentiel à l’activation et à l’adhésion des plaquettes25. Enfin, la protéine kinase extracellulaire régulée par le signal 5 (ERK5), une protéine kinase proposée comme capteur de stress redox dans les plaquettes26, est activée par O2•- et induit un phénotype procoagulant dans les plaquettes (tel qu’estimé par la mesure basée sur la cytométrie en flux de l’externalisation de la phosphatidylsérine)27.

La dérégulation de la génération d’O2•- et d’autres ROS dans les plaquettes a été associée à une réponse hémostatique exagérée entraînant des complications cardiovasculaires thrombotiques associées à l’athérosclérose, au diabète sucré, à l’hypertension, à l’obésité et au cancer28,29. Dans ces contextes pathologiques, la production de ROS par les plaquettes est augmentée, ce qui conduit à une potentialisation de leurs réponses adhésives et agrégatoires. En plus de l’effet sur les réponses plaquettaires, la production de radicaux libres par les plaquettes peut avoir des conséquences sur d’autres cellules sanguines et structures vasculaires, ce qui est un domainede la santé cardiovasculaire mal compris et sous-étudié. Malgré notre compréhension limitée des mécanismes moléculaires reliant le stress oxydatif aux conditions thrombotiques, la pertinence clinique des antioxydants pour la protection contre les maladies cardiovasculaires a fait l’objet d’une attention considérable. Il a été démontré que les niveaux d’antioxydants plasmatiques sont inversement corrélés avec le risque de développer des maladies cardiovasculaires, et il a été démontré que la consommation d’antioxydants alimentaires protège contre les maladies coronariennes31,32. Par conséquent, l’utilisation d’antioxydants alimentaires a été préconisée comme une approche prometteuse pour la prévention des maladies cardiovasculaires 33,34,35. Parmi les effets de la génération de ROS dans les plaquettes, l’augmentation de l’apoptose peut avoir des effets physiopathologiques importants36,37. Dans l’ensemble, des protocoles fiables pour détecter et quantifier la production d’O2•- par les plaquettes sont de plus en plus pertinents dans la recherche cardiovasculaire.

À l’heure actuelle, les techniques disponibles pour la détection des ROS présentent d’importantes limites en termes de spécificité (c’est-à-dire que la nature chimique des molécules oxydantes détectées est inconnue) et de fiabilité (c’est-à-dire que l’interaction indésirable avec les molécules biologiques et les réactifs expérimentaux conduit à des résultats non physiologiques biaisés)38,39. L’approche la plus couramment utilisée pour la détection des ROS dans les plaquettes est basée sur l’utilisation du diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFDA), qui est converti en dichlorodihydrofluorescéine (DCFH) par les estérases intracellulaires et par conséquent en dichlorofluorescéine hautement fluorescente (DCF) par les oxydants cellulaires, y compris les radicaux hydroxyles et les intermédiaires de la peroxydase-H2O2 40,41. Malgré sa large utilisation, de sérieuses questions ont été soulevées quant à la fiabilité de cette approche pour la mesure des ROS38 intracellulaires. L’oxydation du DCFH en DCF peut en effet être induite par des ions de métaux de transition (par exemple, Fe2+) ou des enzymes contenant de l’hème (par exemple, les cytochromes) au lieu de ROS42. De plus, le DCFDA est converti par les peroxydases cellulaires en sa forme de radical libre semiquinone (DCF•-), qui est à son tour oxydée en DCF par réaction avec l’oxygène moléculaire (O2) avec la libération de O2•-, ce qui conduit à l’amplification artificielle des réponses oxydatives 41,43,44. Par conséquent, la détection des ROS intracellulaires par le DCFDA est utile pour obtenir des informations initiales, mais nécessite une réflexion prudente et des contrôles expérimentaux approfondis38,39.

Cette étude présente trois techniques alternatives pour la détection et la mesure du régulateur clé de la fonction plaquettaire O2•-1. La première technique est la détection à l’aide de la DHE et de la cytométrie en flux, qui offre des avantages de fiabilité et de spécificité par rapport à la DCFDA. La deuxième technique proposée ici utilise également la DHE, mais la méthode de détection est l’imagerie par fluorescence plaquettaire en direct, qui permet d’étudier la génération d’O2•- lors de la signalisation plaquettaire avec une cinétique rapide et une résolution unicellulaire. Enfin, un protocole basé sur l’utilisation de la sonde de spin d’hydroxylamine 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH) dans des expériences de résonance EPR offre la possibilité de quantifier le taux de génération d’O2•- par les plaquettes et de le comparer dans différentes conditions.

Protocole

Le prélèvement de sang périphérique sur des volontaires consentants est approuvé par le comité d’éthique local et l’autorité nationale de recherche en santé du service national de santé (référence REC : 21/SC/0215 ; Numéro d’identification IRAS : 283854).

1. Méthode 1 : Détection des anions superoxydes à l’aide de la DHE par cytométrie en flux

  1. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
  2. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
  3. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
  4. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
  5. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM d’acide sulfonique 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthane sulfonique (HEPES), 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH de 7,3) (37 °C) à une densité de 2 x 108 plaquettes/mL.
  6. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
  7. Préparez la DHE dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration de matière première de 5 mM.
  8. Ajouter la DHE à la suspension plaquettaire à une concentration finale de 5 μM (diluer la solution mère 1 à 1 000, avec une concentration finale de DMSO de 0,1 % v/v) et incuber pendant 15 min à 37 °C.
  9. Traiter les plaquettes avec des agents pharmacologiques et/ou des piégeurs de ROS pendant 15 minutes avant la stimulation avec les stimuli physiologiques et les concentrations souhaités (par exemple, 0,1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène).
  10. Après stimulation, diluer les suspensions plaquettaires 1 à 10 dans un tampon HEPES modifié glacé.
  11. Pour la cytométrie en flux, utilisez le gain de diffusion latérale (SSC) et de diffusion directe (FSC) à 40 mV et 220 mV, respectivement, et utilisez des diagrammes de dispersion à l’échelle logarithmique pour visualiser la population de particules en suspension (exemple de la figure 1A).
  12. (FACULTATIF) Immunocoloration d’une aliquote de suspension plaquettaire à l’aide d’un anticorps anti-CD41 pour identifier la population d’événements correspondant aux plaquettes (exemple sur la figure 1B).
  13. Analysez des échantillons par cytométrie en flux en utilisant l’excitation à 405 nm (laser violet) et l’émission à la longueur d’onde de 580 nm, qui détecte sélectivement le produit spécifique de l’anion superoxyde 2-hydroxy-éthidium (2OH-Et+) (Figure 2).
    REMARQUE : La fixation avec du paraformaldéhyde et le stockage à long terme des échantillons ne sont pas conseillés.

2. Méthode 2 : Détection d’anions superoxydes à l’aide de la DHE par imagerie par fluorescence plaquettaire unique

  1. Le jour de l’expérience, enduire une lame de μ à 8 puits avec 0,1 mg/mL de collagène fibrillaire I provenant de tendons équins (collagène Horm), 0,2 mg/mL de fibrinogène ou 1 mg/mL de poly-L-lysine (PLL) dans un tampon Tyrode modifié pendant 2 h à 37 °C.
  2. Laver deux fois avec le tampon Tyrode modifié (10 min chacun).
  3. Homologation de l’adhérence non spécifique par incubation dans un tampon de Tyrode modifié plus 5 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) pendant au moins 30 minutes (ou jusqu’à l’expérience).
  4. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
  5. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
  6. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
  7. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
  8. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM d’HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH de 7,3) (37 °C) à une densité de 4 x 107 plaquettes/mL.
  9. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
  10. Préparer la DHE dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration de stock de 10 mM.
  11. Ajouter de la DHE à une concentration finale de 10 μM dans la suspension plaquettaire (diluer la solution mère 1 à 1 000, avec une concentration finale de DMSO de 0,1 % v/v) et incuber pendant 1 min (37 °C).
  12. Après 1 min d’incubation avec DHE, retirez la solution de blocage des puits choisis, positionnez la lame de μ sur la platine du microscope prête pour l’imagerie et distribuez doucement les plaquettes.
  13. Surveillez la conversion de la DHE en 2OH-Et+ par imagerie confocale inversée pendant 10 min (405/580 nm ex/em), avec des images collectées toutes les 10 s avec un objectif d’immersion dans l’huile 40x.
  14. (FACULTATIF) Pour les puits recouverts de PLL, surveiller la production d’anions superoxyde en réponse à un agoniste soluble (p. ex., 0,1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène) en ajoutant l’agoniste 10 minutes après la distribution des plaquettes et la collecte d’images de fluorescence pendant 10 minutes supplémentaires, comme décrit à l’étape 2.13.
  15. (FACULTATIF) Au besoin, ajouter des piégeurs d’anions superoxydes ou des inhibiteurs sélectifs (p. ex., inhibiteur de NOX) en distribuant doucement sur le côté du puits pendant la durée et recueillir des images de fluorescence comme décrit à la section 2.13 pendant 10 minutes supplémentaires.
  16. Quantifiez l’analyse de fluorescence unicellulaire en sélectionnant la région d’intérêt (ROI) contenant des plaquettes uniques représentatives et en analysant l’intensité de fluorescence dans différentes images avec l’outil de mesure de la suite d’imagerie ImageJ 1.53t.

3. Méthode 3 : Détection de l’anion superoxyde par les plaquettes à l’aide de la résonance paramagnétique électronique (EPR)

  1. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
  2. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
  3. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
  4. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
  5. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glucose, pH 7,3) (37 °C) à une densité de 2 x 108 plaquettes/mL.
  6. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
  7. Ajouter 5 μM de diéthyldithiocarbamate (DETC) et 25 μM de déféroxamine à la suspension plaquettaire.
  8. Sans incubation, ajouter 200 μM de 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH).
  9. Chargez les échantillons sur l’agrégateur à l’intérieur des cuvettes d’agrégation (y compris les aimants d’agitation recouverts de téflon).
  10. Après 1 min, ajoutez les stimuli à la concentration souhaitée (par exemple, 1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène). Incuber pendant 10 min.
  11. (FACULTATIF) Obtenez la génération d’anions superoxydes à différents moments en passant à l’étape 3.12 au moment souhaité.
  12. Transférez la suspension plaquettaire de la cuvette d’agrégation dans un tube de microcentrifugation et tournez-la rapidement à 6 000 x g pendant 10 s.
  13. Chargez 50 μL du surnageant dans des micropipettes capillaires et scellez-les avec de la cire à cacheter EPR.
  14. Transférez les échantillons vers le scanner EPR.
  15. Réglez le scanner EPR comme suit : champ central 3 492,5 G, balayage de champ 60 G, amplitude de modulation 2 G, temps de balayage 10 s, nombre de balayages 10, fréquence micro-ondes 9,39 GHz, puissance micro-ondes 20 mW, temps de conversion 327,68 ms, constante de temps 5242,88 ms.
  16. Estimez l’oxydation du CMH en CM● comme l’aire sous la courbe (AUC) des pics EPR enregistrés à l’aide des paramètres ci-dessus.
  17. Construisez une courbe d’étalonnage traçant l’intensité de l’EPR mesurée comme décrit à l’étape 3.16 sur l’axe des y et les concentrations du CM● disponible dans le commerce sur l’axe des x (par exemple, 0, 0,3, 1, 3, 10 et 30 μM).
  18. À partir de la concentration CM● dans les échantillons, obtenir la quantité d’anion superoxyde générée par les plaquettes dans les échantillons à l’aide des formules décrites dans la section Résultats représentatifs.

Résultats

Pour la détection par cytométrie en flux de la fluorescence de la DHE, nous montrons des résultats représentatifs pour les plaquettes au repos (Figure 3A) ou stimulées avec 0,1 unité/mL de thrombine (Figure 3B). La production d’O2•- a été quantifiée en tant qu’intensité moyenne de fluorescence plaquettaire (MFI), comme le montre la stimulation avec 0,1 unité/mL de thrombine (

Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons trois techniques différentes ayant le potentiel de faire progresser la capacité d’étudier la régulation dépendante de l’oxydoréduction de la fonction plaquettaire via la détection sélective de O2•-. Les deux premières méthodes sont une amélioration par rapport aux techniques existantes en raison de la sonde redox utilisée (DHE au lieu de la DCFDA, plus courante mais moins fiable). Ces techniques sont d...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la British Heart Foundation (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) et les subventions du Conseil européen de la recherche (#10102507) à G. Pula.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

Références

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