Méthodes alternatives pour la détection de la génération d’anions superoxyde dans les plaquettes

Résumé

La génération d’anions superoxydes est essentielle pour la stimulation des plaquettes et, si elle est dérégulée, critique pour les maladies thrombotiques. Nous présentons ici trois protocoles pour la détection sélective des anions superoxyde et l’étude de la régulation plaquettaire dépendante de l’oxydoréduction.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules contenant de l’oxygène très instables. Leur instabilité chimique les rend extrêmement réactifs et leur donne la capacité de réagir avec des molécules biologiques importantes telles que les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Les anions superoxydes sont des ROS importants générés par la réduction de la réduction moléculaire de l’oxygène (c’est-à-dire l’acquisition d’un électron). Malgré leur implication initiale exclusivement dans le vieillissement, les processus dégénératifs et pathogènes, leur participation à d’importantes réponses physiologiques est récemment devenue apparente. Dans le système vasculaire, il a été démontré que les anions superoxydes modulent la différenciation et la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires, la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires dans l’angiogenèse, la réponse immunitaire et l’activation des plaquettes dans l’hémostase. Le rôle des anions superoxydes est particulièrement important dans la dérégulation des plaquettes et les complications cardiovasculaires associées à une pléthore de conditions, notamment le cancer, les infections, l’inflammation, le diabète et l’obésité. Il est donc devenu extrêmement pertinent dans la recherche cardiovasculaire de pouvoir mesurer efficacement la génération d’anions superoxydes par les plaquettes humaines, de comprendre les mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’équilibre entre l’hémostase et la thrombose et, éventuellement, d’identifier de nouveaux outils pharmacologiques pour la modulation des réponses plaquettaires conduisant à la thrombose et aux complications cardiovasculaires. Cette étude présente trois protocoles expérimentaux adoptés avec succès pour la détection des anions superoxydes dans les plaquettes et l’étude des mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’hémostase et la thrombose : 1) détection d’anions superoxydes à base de dihydroéthidium (DHE) par cytométrie en flux ; 2) visualisation et analyse des anions superoxydes à base de DHE par imagerie plaquettaire unique ; et 3) la quantification par sonde de spin de la production d’anions superoxydes dans les plaquettes par résonance paramagnétique électronique (EPR).

Introduction

L’anion superoxyde (O₂^•-) est le ROS le plus pertinent sur le plan fonctionnel généré dans les plaquettes¹. O₂^•- est le produit de la réduction de l’oxygène moléculaire et le précurseur de nombreux ROS ² différents. La dismutation de O₂^•- conduit à la génération de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) par des réactions spontanées en solution aqueuse ou des réactions catalysées par des superoxydes dismutases (SODs³). Bien que différentes sources enzymatiques aient été suggérées (par exem....

Protocole

Le prélèvement de sang périphérique sur des volontaires consentants est approuvé par le comité d’éthique local et l’autorité nationale de recherche en santé du service national de santé (référence REC : 21/SC/0215 ; Numéro d’identification IRAS : 283854).

1. Méthode 1 : Détection des anions superoxydes à l’aide de la DHE par cytométrie en flux

1. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
2. Prélever du sang humain ....

Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons trois techniques différentes ayant le potentiel de faire progresser la capacité d’étudier la régulation dépendante de l’oxydoréduction de la fonction plaquettaire via la détection sélective de O₂^•-. Les deux premières méthodes sont une amélioration par rapport aux techniques existantes en raison de la sonde redox utilisée (DHE au lieu de la DCFDA, plus courante mais moins fiable). Ces techniques sont d.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope