Metodi alternativi per la rilevazione della generazione di anioni superossido nelle piastrine

Riepilogo

La generazione di anione superossido è essenziale per la stimolazione delle piastrine e, se disregolata, fondamentale per le malattie trombotiche. Qui, presentiamo tre protocolli per la rilevazione selettiva di anioni superossido e lo studio della regolazione piastrinica redox-dipendente.

Abstract

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente instabili contenenti ossigeno. La loro instabilità chimica li rende estremamente reattivi e conferisce loro la capacità di reagire con importanti molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e lipidi. Gli anioni superossido sono importanti ROS generati dalla riduzione della riduzione molecolare dell'ossigeno (cioè l'acquisizione di un elettrone). Nonostante le loro implicazioni iniziali esclusivamente nei processi di invecchiamento, degenerativi e patogeni, la loro partecipazione a importanti risposte fisiologiche è recentemente diventata evidente. Nel sistema vascolare, è stato dimostrato che gli anioni superossido modulano la differenziazione e la funzione delle cellule muscolari lisce vascolari, la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali vascolari nell'angiogenesi, la risposta immunitaria e l'attivazione delle piastrine nell'emostasi. Il ruolo degli anioni superossido è particolarmente importante nella disregolazione delle piastrine e nelle complicanze cardiovascolari associate a una pletora di condizioni, tra cui cancro, infezioni, infiammazioni, diabete e obesità. È quindi diventato estremamente rilevante nella ricerca cardiovascolare essere in grado di misurare efficacemente la generazione di anioni superossido da parte delle piastrine umane, comprendere i meccanismi redox-dipendenti che regolano l'equilibrio tra emostasi e trombosi e, infine, identificare nuovi strumenti farmacologici per la modulazione delle risposte piastriniche che portano a trombosi e complicanze cardiovascolari. Questo studio presenta tre protocolli sperimentali adottati con successo per la rilevazione di anioni superossido nelle piastrine e lo studio dei meccanismi redox-dipendenti che regolano l'emostasi e la trombosi: 1) rivelazione di anioni superossido a base di diidroetidio (DHE) mediante citometria a flusso; 2) Visualizzazione e analisi di anioni superossido basati su DHE mediante imaging di singole piastrine; e 3) quantificazione basata su sonda di spin dell'output di anioni superossido nelle piastrine mediante risonanza paramagnetica elettronica (EPR).

Introduzione

L'anione superossido (O₂^•-) è il ROS più rilevante dal punto di vista funzionale generato nelle piastrine¹. O₂^•- è il prodotto della riduzione dell'ossigeno molecolare ed è il precursore di molti ROS ² diversi. La dismutazione di O₂^•- porta alla generazione di perossido di idrogeno (H₂O₂) tramite reazioni spontanee in soluzione acquosa o reazioni catalizzate da superossido dismutasi (SODs³). Sebbene siano state suggerite diverse fonti enzimatiche (ad esempio, xantina ossidasi

Protocollo

La raccolta di sangue periferico da volontari consenzienti è approvata dal Comitato Etico locale e dall'Autorità per la Ricerca Sanitaria Nazionale (riferimento REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Metodo 1: Rilevazione dell'anione superossido mediante DHE mediante citometria a flusso

1. Preriscaldare (37 °C) la soluzione di citrato di sodio (4% p/v) e utilizzarla come anticoagulante aggiungendola direttamente nel sangue al momento della puntura venosa in un rapporto di 1:7 (0,5% p/v finale).
2. Prelevare sangue umano periferico da volontari sani mediante puntura venosa della....

Discussione

In questo manoscritto, presentiamo tre diverse tecniche con il potenziale di migliorare la capacità di studiare la regolazione redox-dipendente della funzione piastrinica attraverso la rilevazione selettiva di O₂^•-. I primi due metodi sono un miglioramento rispetto alle tecniche esistenti grazie alla sonda redox utilizzata (DHE invece della più comune ma meno affidabile DCFDA). Queste tecniche sono, quindi, facilmente accessibili e la maggior parte de.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope