Альтернативные методы определения образования супероксид-анионов в тромбоцитах

Резюме

Образование супероксид-аниона имеет важное значение для стимуляции тромбоцитов и, в случае его нерегуляции, имеет решающее значение для тромботических заболеваний. В данной работе мы представляем три протокола для селективного детектирования супероксид-анионов и изучения редокс-зависимой регуляции тромбоцитов.

Аннотация

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой крайне нестабильные молекулы, содержащие кислород. Их химическая нестабильность делает их чрезвычайно реактивными и дает им способность реагировать с важными биологическими молекулами, такими как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Супероксидные анионы являются важными АФК, образующимися при восстановлении молекулярного восстановления кислорода (т.е. приобретении одного электрона). Несмотря на то, что первоначально они участвовали исключительно в старении, дегенеративных и патогенных процессах, в последнее время их участие в важных физиологических реакциях стало очевидным. Было показано, что в сосудистой системе супероксид-анионы модулируют дифференцировку и функцию гладкомышечных клеток сосудов, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сосудов в ангиогенезе, иммунный ответ и активацию тромбоцитов в гемостазе. Роль супероксид-анионов особенно важна в нарушении регуляции тромбоцитов и сердечно-сосудистых осложнениях, связанных с множеством заболеваний, включая рак, инфекции, воспаления, диабет и ожирение. Таким образом, в сердечно-сосудистых исследованиях стало чрезвычайно актуальным иметь возможность эффективно измерять образование супероксид-анионов тромбоцитами человека, понимать редокс-зависимые механизмы, регулирующие баланс между гемостазом и тромбозом, и, в конечном итоге, идентифицировать новые фармакологические инструменты для модуляции тромбоцитарных реакций, ведущих к тромбозу и сердечно-сосудистым осложнениям. В данном исследовании представлены три экспериментальных протокола, успешно принятых для обнаружения супероксид-анионов в тромбоцитах и изучения редокс-зависимых механизмов, регулирующих гемостаз и тромбоз: 1) обнаружение супероксид-анионов на основе дигидроэтидия (ДГЭ) методом проточной цитометрии; 2) Визуализация и анализ супероксид-анионов на основе ДГЭ с помощью визуализации одиночных тромбоцитов; и 3) количественное определение выхода супероксид-анионов в тромбоцитах с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на основе спинового зонда.

Введение

Супероксид-анион (O₂^•-) является наиболее функционально значимым АФК, образующимся в тромбоцитах¹. O₂^•- является продуктом восстановления молекулярного кислорода и предшественником многих различных АФК ². Дисмутация O₂^•- приводит к образованию перекиси водорода (H₂O₂) в результате спонтанных реакций в водном растворе или реакций, катализируемых супероксиддисмутазами (SODs³). Несмотря на то, что были предложены различные ферментативные источники (например, ксантиноксидаза

протокол

Забор периферической крови у добровольцев по обоюдному согласию одобрен местным Комитетом по этике и Национальным управлением по исследованиям в области здравоохранения Национальной службы здравоохранения (ссылка REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Метод 1: Обнаружение супероксид-анионов с помощью DHE методом проточной цитометрии

1. Предварительно подогрейте (37 °C) раствор цитрата натрия (4% по объему) и используйте его в качестве антикоагулянта, добавляя его непосредственно в кровь во время венепункции в соотношении 1:7 (0,5% по сравнению с объемом).
2. Забор периферическо....

Результаты

Для определения флуоресценции DHE с помощью проточной цитометрии мы показываем репрезентативные результаты для тромбоцитов, находящихся либо в состоянии покоя (рис. 3A), либо стимулированных тромбином 0,1 ЕД/мл (рис. 3B). Выход O₂^•

Обсуждение

В этой рукописи мы представляем три различных метода, которые могут расширить возможности исследования редокс-зависимой регуляции функции тромбоцитов посредством селективного обнаружения O₂^•-. Первые два метода являются улучшением существующих м?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope