Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler

Özet

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS), oldukça kararsız oksijen içeren moleküllerdir. Kimyasal kararsızlıkları onları son derece reaktif hale getirir ve onlara proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi önemli biyolojik moleküllerle reaksiyona girme yeteneği verir. Süperoksit anyonları, moleküler oksijen indirgenmesinin indirgenmesiyle (yani bir elektronun elde edilmesi) üretilen önemli ROS'lardır. İlk başta yalnızca yaşlanma, dejeneratif ve patojenik süreçlerdeki etkilerine rağmen, önemli fizyolojik tepkilere katılımları son zamanlarda belirgin hale gelmiştir. Vasküler sistemde, süperoksit anyonlarının vasküler düz kas hücrelerinin farklılaşmasını ve fonksiyonunu, anjiyogenezde vasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü, immün yanıtı ve hemostazda trombositlerin aktivasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Süperoksit anyonlarının rolü, trombositlerin düzensizliğinde ve kanser, enfeksiyon, iltihaplanma, diyabet ve obezite dahil olmak üzere çok sayıda durumla ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlarda özellikle önemlidir. Bu nedenle, insan trombositleri tarafından süperoksit anyonlarının oluşumunu etkili bir şekilde ölçebilmek, hemostaz ve tromboz arasındaki dengeyi düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaları anlayabilmek ve nihayetinde tromboz ve kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan trombosit yanıtlarının modülasyonu için yeni farmakolojik araçları tanımlayabilmek kardiyovasküler araştırmalarda son derece önemli hale gelmiştir. Bu çalışma, trombositlerdeki süperoksit anyonlarının tespiti ve hemostaz ve trombozu düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaların incelenmesi için başarıyla benimsenen üç deneysel protokol sunmaktadır: 1) akış sitometrisi ile dihidroetidyum (DHE) bazlı süperoksit anyon tespiti; 2) Tek trombosit görüntüleme ile DHE bazlı süperoksit anyon görselleştirme ve analizi; ve 3) elektron paramanyetik rezonans (EPR) ile trombositlerdeki süperoksit anyon çıkışının spin probu tabanlı miktar tayini.

Giriş

Süperoksit anyonu (O₂ ^{• -}), trombositler^1'de üretilen işlevsel olarak en ilgili ROS'tur. O₂ ^{• -} moleküler oksijenin indirgenmesinin ürünü ve birçok farklı ROS ^2'nin öncüsüdür. O₂ ^{• -} 'nin dismutasyonu, sulu çözeltideki spontan reaksiyonlar veya süperoksit dismutazlar (SOD'ler³) tarafından katalize edilen reaksiyonlar yoluyla hidrojen peroksit (H₂O₂) oluşumuna yol açar. Farklı enzimatik kaynaklar önerilmiş olsa da (örneğin, ksantin oksidaz⁴, lipoksijenaz<....

Protokol

Onay veren gönüllülerden periferik kan toplanması yerel Etik Kurul ve Ulusal Sağlık Hizmeti Sağlık Araştırma Kurumu tarafından onaylanmıştır (REC referansı: 21/SC/0215; IRAS Kimliği: 283854).

1. Yöntem 1: Akış sitometrisi ile DHE kullanarak süperoksit anyon tespiti

1. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
2. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
3. 20 dakika boyunca 200 x g'd....

Tartışmalar

Bu yazıda, O₂ ^{• -}'nin seçici tespiti yoluyla trombosit fonksiyonunun redoksa bağlı regülasyonunu araştırma yeteneğini geliştirme potansiyeline sahip üç farklı teknik sunuyoruz. İlk iki yöntem, kullanılan redoks probu (daha yaygın ancak daha az güvenilir DCFDA yerine DHE) nedeniyle mevcut tekniklerde bir gelişmedir. Bu nedenle, bu tekniklere kolayca erişilebilir ve çoğu laboratuvar, belirli ekipman veya eğitim maliyetleri olmadan bu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope