JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS), oldukça kararsız oksijen içeren moleküllerdir. Kimyasal kararsızlıkları onları son derece reaktif hale getirir ve onlara proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi önemli biyolojik moleküllerle reaksiyona girme yeteneği verir. Süperoksit anyonları, moleküler oksijen indirgenmesinin indirgenmesiyle (yani bir elektronun elde edilmesi) üretilen önemli ROS'lardır. İlk başta yalnızca yaşlanma, dejeneratif ve patojenik süreçlerdeki etkilerine rağmen, önemli fizyolojik tepkilere katılımları son zamanlarda belirgin hale gelmiştir. Vasküler sistemde, süperoksit anyonlarının vasküler düz kas hücrelerinin farklılaşmasını ve fonksiyonunu, anjiyogenezde vasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü, immün yanıtı ve hemostazda trombositlerin aktivasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Süperoksit anyonlarının rolü, trombositlerin düzensizliğinde ve kanser, enfeksiyon, iltihaplanma, diyabet ve obezite dahil olmak üzere çok sayıda durumla ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlarda özellikle önemlidir. Bu nedenle, insan trombositleri tarafından süperoksit anyonlarının oluşumunu etkili bir şekilde ölçebilmek, hemostaz ve tromboz arasındaki dengeyi düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaları anlayabilmek ve nihayetinde tromboz ve kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan trombosit yanıtlarının modülasyonu için yeni farmakolojik araçları tanımlayabilmek kardiyovasküler araştırmalarda son derece önemli hale gelmiştir. Bu çalışma, trombositlerdeki süperoksit anyonlarının tespiti ve hemostaz ve trombozu düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaların incelenmesi için başarıyla benimsenen üç deneysel protokol sunmaktadır: 1) akış sitometrisi ile dihidroetidyum (DHE) bazlı süperoksit anyon tespiti; 2) Tek trombosit görüntüleme ile DHE bazlı süperoksit anyon görselleştirme ve analizi; ve 3) elektron paramanyetik rezonans (EPR) ile trombositlerdeki süperoksit anyon çıkışının spin probu tabanlı miktar tayini.

Giriş

Süperoksit anyonu (O2 • -), trombositler1'de üretilen işlevsel olarak en ilgili ROS'tur. O2 • - moleküler oksijenin indirgenmesinin ürünü ve birçok farklı ROS 2'nin öncüsüdür. O2 • - 'nin dismutasyonu, sulu çözeltideki spontan reaksiyonlar veya süperoksit dismutazlar (SOD'ler3) tarafından katalize edilen reaksiyonlar yoluyla hidrojen peroksit (H2O2) oluşumuna yol açar. Farklı enzimatik kaynaklar önerilmiş olsa da (örneğin, ksantin oksidaz4, lipoksijenaz5, siklooksijenaz6 ve nitrik oksit sentaz7), mitokondriyal solunum 8,9 ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat-oksidazlar (NOX'ler)10 ökaryotik hücrelerde en belirgin süperoksit anyonu kaynaklarıdır. Bu aynı zamanda, mitokondriyal solunumdan(11,12) elektron sızıntısının ve NOX'lerin13,14 enzimatik aktivitesinin, süperoksit anyon çıkışına ana katkıda bulunanlar olarak tanımlandığı trombositlerde de geçerli gibi görünmektedir.

Her ne kadar birkaç çalışma trombositlerin O2 • - tarafından düzenlenmesine odaklanmış olsa da, sorumlu moleküler mekanizmalar konusunda bir fikir birliği yoktur. Farklı trombosit reseptörleri için doğrudan oksidasyon ve disülfid bağı oluşumu yoluyla yüzey reseptör aktivitesinin modülasyonu önerilmiştir. Sistein kalıntılarının doğrudan oksidasyonu yoluyla integrin αIIbβ3'ün ROS tarafından pozitif regülasyonu önerilmiştir 15,16,17. Benzer şekilde, kollajene trombosit yanıtları, disülfide bağımlı dimerizasyona ve bunun sonucunda glikoprotein VI'nın (GPVI) 18 dimerizasyonuna bağlı olduğundan, deneysel olarak tam olarak kanıtlanmamış olsa da, ROS'a bağlı oksidasyon ile reseptör aktivitesi güçlendirmesi önerilmiştir19. Son olarak, glikoprotein Ib'nin (GPIb) sülfhidril gruplarının ROS ile indüklenen oksidasyonunun, inflamasyon20 sırasında trombosit yapışmasını ve trombosit-lökosit etkileşimini teşvik ettiği gösterilmiştir. Tersine, azalmış sülfhidril grubu oksidasyonu ve reseptör aktivasyonunun olası bir sonucu olarak, hem GPVI hem de GPIb'nin ektodomaininin dökülmesi, koşullarınazaltılmasıyla azalır 21.

Trombosit yüzey reseptörlerinin doğrudan oksidasyonundan bağımsız olarak etki modları da önerilmiştir. O2 • - dahil olmak üzere ROS'un, bu reseptörün22 sinyal kaskadını negatif olarak düzenleyen Src homoloji bölgesi 2 içeren protein tirozin fosfataz 2'nin (SHP-2) aktivitesini zayıflatarak kollajen reseptörü GPVI'yı pozitif olarak modüle ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, O2 • - nitrik oksit (NO) ile hızlı reaksiyon yoluyla ONOO- (peroksinitrit) üretebilir, bu da normalde NO'ya duyarlı guanilil siklaz (NO-GC) yoluyla trombositleri inhibe eder ve negatif trombosit düzenleyici siklik GMP'nin (cGMP) oluşumunu engeller23,24. NO seviyelerinde ortaya çıkan azalma trombosit potansiyasyonuna yol açabilir. Alternatif olarak, NOX2 ile O 2 • - oluşumunun, trombosit aktivasyonu ve yapışma25 için gerekli olan lipid peroksidasyonuna ve izoprostan oluşumuna katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Son olarak, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) hücre dışı sinyal regüle kinaz 5 (ERK5), trombositlerde26 redoks stres sensörü olarak önerilen bir protein kinaz, O2 • - tarafından aktive edilir ve trombositlerde bir prokoagülan fenotipi indükler (fosfatidilserin dışsallaştırmasının akış sitometrisi tabanlı ölçümü ile tahmin edildiği gibi)27.

Trombositlerde O2 • - ve diğer ROS oluşumunun düzensizliği, ateroskleroz, diabetes mellitus, hipertansiyon, obezite ve kanser ile ilişkili trombotik kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan abartılı hemostatik yanıt ile ilişkilendirilmiştir28,29. Bu patolojik ortamlarda, trombositler tarafından ROS çıkışı artar, bu da yapışkan ve agregatör yanıtlarının güçlenmesine yol açar. Trombosit yanıtları üzerindeki etkisine ek olarak, trombositlerin serbest radikal çıkışının diğer kan hücreleri ve vasküler yapılar üzerinde sonuçları olabilir, bu da kardiyovasküler sağlığın yeterince anlaşılmamış ve yeterince araştırılmamış bir alanıdır30. Oksidatif stresi trombotik durumlara bağlayan moleküler mekanizmalar hakkındaki sınırlı anlayışımıza rağmen, kardiyovasküler hastalıklara karşı korunmada antioksidanların klinik önemi büyük ilgi görmüştür. Plazma antioksidan seviyelerinin kardiyovasküler rahatsızlıklar geliştirme riski ile ters orantılı olduğu gösterilmiştir ve diyetle antioksidan tüketiminin koroner arter hastalığına karşı koruma sağladığı gösterilmiştir31,32. Sonuç olarak, diyetle alınan antioksidanların kullanımı kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi için umut verici bir yaklaşım olarak savunulmuştur 33,34,35. Trombositlerde ROS oluşumunun etkileri arasında, apoptozdaki artışın önemli patofizyolojik etkileri olabilir36,37. Genel olarak, trombositler tarafından O2 • - çıktısını tespit etmek ve ölçmek için güvenilir protokoller kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha fazla önem kazanmaktadır.

Şu anda, ROS'un tespiti için mevcut teknikler, özgüllük (yani, tespit edilen oksidan moleküllerinin kimyasal doğası bilinmemektedir) ve güvenilirlik (yani, biyolojik moleküller ve deneysel reaktifler ile istenmeyen etkileşim, önyargılı fizyolojik olmayan sonuçlara yol açmaktadır) önemli sınırlamalara sahiptir38,39. Trombositlerde ROS'un saptanması için en yaygın olarak kullanılan yaklaşım, hücre içi esterazlar tarafından diklorodihidrofloreseine (DCFH) ve sonuç olarak hidroksil radikalleri ve peroksida-H2O2 ara ürünleri dahil olmak üzere hücresel oksidanlar tarafından yüksek floresan diklorofloreseine (DCF) dönüştürülen diklorodihidrofloresein diasetat (DCFDA) kullanımına dayanmaktadır40,41. Geniş kullanımına rağmen, hücre içi ROS38 ölçümü için bu yaklaşımın güvenilirliği ile ilgili ciddi sorular gündeme gelmiştir. DCFH'nin DCF'ye oksidasyonu, aslında, ROS42 yerine geçiş metali iyonları (örneğin, Fe2 +) veya hem içeren enzimler (örneğin, sitokromlar) tarafından indüklenebilir. Ayrıca, DCFDA, hücre peroksidazları tarafından semikinon serbest radikal formuna (DCF • -) dönüştürülür, bu da moleküler oksijen (O2 ) ile reaksiyona girerek DCF'ye oksitlenir ve O2 • - salınımı ile oksidatif reaksiyonların yapay amplifikasyonuna yol açar 41,43,44. Bu nedenle, hücre içi ROS'un DCFDA tarafından saptanması, ilk içgörüleri elde etmek için yararlıdır, ancak dikkatli bir değerlendirme ve kapsamlı deneysel kontroller gerektirir38,39.

Bu çalışma, O2•-1 trombosit fonksiyonunun anahtar düzenleyicisinin tespiti ve ölçümü için üç alternatif teknik sunmaktadır. İlk teknik, DCFDA'ya göre güvenilirlik ve özgüllük avantajları sunan DHE ve akış sitometrisi kullanılarak yapılan tespittir. Burada önerilen ikinci teknik de DHE'yi kullanır, ancak tespit yöntemi, hızlı kinetik ve tek hücre çözünürlüğü ile trombosit sinyalizasyonu üzerine O2 • - oluşumunun incelenmesine izin veren canlı trombosit floresan görüntülemedir. Son olarak, EPR rezonans deneylerinde hidroksilamin spin probu 1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH) kullanımına dayanan bir protokol, trombositler tarafından O2 • - oluşum oranını ölçme ve farklı koşullarda karşılaştırma imkanı sunar.

Protokol

Onay veren gönüllülerden periferik kan toplanması yerel Etik Kurul ve Ulusal Sağlık Hizmeti Sağlık Araştırma Kurumu tarafından onaylanmıştır (REC referansı: 21/SC/0215; IRAS Kimliği: 283854).

1. Yöntem 1: Akış sitometrisi ile DHE kullanarak süperoksit anyon tespiti

  1. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  2. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  3. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  4. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetan sülfonik asit (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 ° C) 2 x 108 trombosit/mL yoğunlukta.
  6. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  7. DHE'yi dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5 mM'lik bir stok konsantrasyonunda hazırlayın.
  8. 5 μM nihai konsantrasyonda trombosit süspansiyonuna DHE ekleyin (stok çözeltisini 1 ila 1.000 arasında seyreltin, nihai DMSO konsantrasyonu% 0.1 v / v ile) ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  9. İstenilen fizyolojik uyaranlar ve konsantrasyonlarla stimülasyondan önce trombositleri 15 dakika boyunca farmakolojik ajanlar ve / veya ROS temizleyicileri ile tedavi edin (ör., 0.1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen).
  10. Stimülasyondan sonra, trombosit süspansiyonlarını buz gibi soğuk modifiye HEPES tamponunda 1 ila 10 arasında seyreltin.
  11. Akış sitometrisi için, sırasıyla 40 mV ve 220 mV'de yan saçılma (SSC) ve ileri saçılma (FSC) kazancını ayarlayın ve süspansiyondaki parçacık popülasyonunu görselleştirmek için logaritmik ölçekli saçılma grafiklerini kullanın ( Şekil 1A'daki örnek).
  12. (İSTEĞE BAĞLI) Trombositlere karşılık gelen olayların popülasyonunu tanımlamak için bir anti-CD41 antikoru kullanarak trombosit süspansiyonunun bir alikotunu immünostain ( Şekil 1B'deki örnek).
  13. Süperoksit anyonuna özgü ürün 2-hidroksi-etidyumu (2OH-Et +) seçici olarak tespit eden 405 nm'de uyarma (mor lazer) ve 580 nm dalga boyunda emisyon kullanarak numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin (Şekil 2).
    NOT: Paraformaldehit ile fiksasyon ve uzun süreli numune saklama tavsiye edilmez.

2. Yöntem 2: Tek trombosit floresan görüntüleme ile DHE kullanılarak süperoksit anyon tespiti

  1. Deney gününde 8 oyuklu bir μ-slaytı at tendonlarından (Horm kollajen) 0.1 mg / mL fibriller kollajen I, 0.2 mg / mL fibrinojen veya 1 mg / mL poli-L-lizin (PLL) ile modifiye Tyrode tamponunda 37 ° C'de 2 saat boyunca kaplayın.
  2. Modifiye Tyrode'un tamponu ile iki kez yıkayın (her biri 10 dakika).
  3. Modifiye Tyrode tamponunda ve 5 mg / mL sığır serum albümininde (BSA) inkübasyon yoluyla en az 30 dakika (veya deneye kadar) spesifik olmayan yapışmayı söndürün.
  4. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  5. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  6. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  7. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 °C) 4 x 107 trombosit/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.
  9. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  10. DHE'yi 10 mM'lik bir stok konsantrasyonunda dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın.
  11. Trombosit süspansiyonuna 10 μM nihai konsantrasyonda DHE ekleyin (stok çözeltisini 1 ila 1.000 arasında seyreltin, son DMSO konsantrasyonu% 0.1 v / v ile) ve 1 dakika (37 ° C) inkübe edin.
  12. DHE ile 1 dakikalık inkübasyondan sonra, bloke edici çözeltiyi seçilen oyuklardan çıkarın, μ slaytı görüntüleme için hazır mikroskop aşamasına yerleştirin ve trombositleri nazikçe dağıtın.
  13. 10 dakika boyunca ters konfokal görüntüleme ile (405/580 nm ex/em) DHE'nin 2OH-Et + 'ya dönüşümünü izleyin ve görüntüler her 10 saniyede bir 40x yağa daldırma lensi ile toplanır.
  14. (İSTEĞE BAĞLI) PLL ile kaplanmış kuyucuklar için, çözünür bir agoniste yanıt olarak süperoksit anyon oluşumunu izleyin (ör., 0.1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen), trombosit dağıtımından 10 dakika sonra agonisti ekleyerek ve floresan görüntü toplamayı 10 dakika daha ekleyerek, adım 2.13'te açıklandığı gibi.
  15. (İSTEĞE BAĞLI) Gerekirse, süperoksit anyon tutucuları veya seçici inhibitörler (ör., NOX inhibitörü) zaman seyri boyunca kuyu tarafına nazikçe dağıtarak ve 10 dakika daha 2.13'te açıklandığı gibi floresan görüntüleri toplayın.
  16. Temsili tek trombositleri içeren İlgi Bölgesini (ROI) seçerek ve ImageJ 1.53t görüntüleme paketinin Ölçüm aracıyla farklı çerçevelerde floresan yoğunluğunu analiz ederek tek hücreli floresan analizini ölçün.

3. Yöntem 3: Elektron paramanyetik rezonans (EPR) kullanılarak trombositler tarafından süperoksit anyonunun tespiti

  1. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  2. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  3. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  4. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 °C) 2 x 108 trombosit/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.
  6. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  7. Trombosit süspansiyonuna 5 μM dietilditiokarbamat (DETC) ve 25 μM deferoksamin ekleyin.
  8. İnkübasyon olmadan 200 μM 1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH) ekleyin.
  9. Numuneleri, agregasyon küvetleri (Teflon kaplı karıştırma mıknatısları dahil) içindeki agregometreye yükleyin.
  10. 1 dakika sonra, uyaranları istenen konsantrasyonda ekleyin (ör., 1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen). 10 dakika inkübe edin.
  11. (İSTEĞE BAĞLI) İstenilen zamanda adım 3.12'ye ilerleyerek farklı zaman noktalarında süperoksit anyon üretimi elde edin.
  12. Trombosit süspansiyonunu agregasyon küvetinden bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 saniye boyunca 6.000 x g'da hızlı bir şekilde döndürün.
  13. Kılcal mikropipetlere 50 μL süpernatan yükleyin ve EPR sızdırmazlık mumu ile kapatın.
  14. Numuneleri EPR tarayıcıya aktarın.
  15. EPR tarayıcıyı aşağıdaki gibi ayarlayın: orta alan 3.492,5 G, alan süpürme 60 G, modülasyon genliği 2 G, tarama süresi 10 s, tarama sayısı 10, mikrodalga frekansı 9,39 GHz, mikrodalga gücü 20 mW, dönüştürme süresi 327,68 ms, zaman sabiti 5242,88 ms.
  16. Yukarıdaki parametreler kullanılarak kaydedilen EPR tepe noktalarının eğrisi (AUC) altındaki alan olarak CMH oksidasyonunu CM● 'ye tahmin edin.
  17. Y ekseninde adım 3.16'da açıklandığı gibi ölçülen EPR yoğunluğunu ve x ekseninde ticari olarak mevcut CM● konsantrasyonlarını (örn. 0, 0.3, 1, 3, 10 ve 30 μM) çizen bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
  18. Numunelerdeki CM● konsantrasyonundan, Temsili Sonuçlar bölümünde açıklanan formülleri kullanarak numunelerdeki trombositler tarafından üretilen süperoksit anyon miktarını elde edin.

Sonuçlar

DHE floresansının akış sitometrisi tespiti için, dinlenen (Şekil 3A) veya 0.1 birim / mL trombin ile uyarılan (Şekil 3B) trombositler için temsili sonuçlar gösteriyoruz. O2 • - çıkışı, 0.1 birim / mL trombin (Şekil 3C) veya 3 μg / mL kollajen ile ilişkili peptit (CRP) (Şekil 3D) ile stimülasyon için gösterildiği...

Tartışmalar

Bu yazıda, O2 • -'nin seçici tespiti yoluyla trombosit fonksiyonunun redoksa bağlı regülasyonunu araştırma yeteneğini geliştirme potansiyeline sahip üç farklı teknik sunuyoruz. İlk iki yöntem, kullanılan redoks probu (daha yaygın ancak daha az güvenilir DCFDA yerine DHE) nedeniyle mevcut tekniklerde bir gelişmedir. Bu nedenle, bu tekniklere kolayca erişilebilir ve çoğu laboratuvar, belirli ekipman veya eğitim maliyetleri olmadan bu...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) ve Avrupa Araştırma Konseyi (#10102507) tarafından G. Pula'ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

Referanslar

  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044 (2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866 (2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713 (2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238 (2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497 (2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 205ROSTrombositlerHemostazTrombozKardiyovask lerDihidroetidyumFlow SitometriTek Trombosit G r nt lemeElektron Paramanyetik RezonansEPR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır