Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות מאוד לא יציבות המכילות חמצן. חוסר היציבות הכימית שלהם הופך אותם לתגובתיים ביותר ומעניק להם את היכולת להגיב עם מולקולות ביולוגיות חשובות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. אניונים סופראוקסידים הם ROS חשובים הנוצרים על ידי הפחתת הפחתת חמצן מולקולרית (כלומר, רכישה של אלקטרון אחד). למרות ההשלכה הראשונית שלהם אך ורק על תהליכי הזדקנות, ניוון ופתוגנים, לאחרונה ניכרה השתתפותם בתגובות פיזיולוגיות חשובות. במערכת כלי הדם, אניונים סופראוקסידים הוכחו כמווסתים את ההתמיינות והתפקוד של תאי שריר חלק וסקולריים, את ההתרבות והנדידה של תאי אנדותל וסקולריים באנגיוגנזה, את התגובה החיסונית ואת ההפעלה של טסיות הדם בהמוסטאזיס. תפקידם של אניונים סופראוקסידים חשוב במיוחד בחוסר ויסות של טסיות הדם ובסיבוכים קרדיווסקולריים הקשורים לשפע של מצבים, כולל סרטן, זיהום, דלקת, סוכרת והשמנת יתר. לכן, זה הפך להיות רלוונטי ביותר במחקר הלב וכלי הדם כדי להיות מסוגל למדוד ביעילות את הדור של אניונים superoxide על ידי טסיות אדם, להבין את המנגנונים תלויי חמצון-חיזור המווסתים את האיזון בין hemostasis ופקקת, ובסופו של דבר, לזהות כלים פרמקולוגיים חדשים עבור אפנון של תגובות טסיות המוביל פקקת וסיבוכים קרדיווסקולריים. מחקר זה מציג שלושה פרוטוקולים ניסיוניים שאומצו בהצלחה לזיהוי אניונים סופראוקסידים בטסיות הדם ולחקר המנגנונים תלויי החיזור המווסתים המוסטזיס ופקקת: 1) זיהוי אניון סופראוקסיד מבוסס דיהידרואתידיום (DHE) באמצעות ציטומטריית זרימה; 2) הדמיה וניתוח של אניון סופראוקסיד מבוסס DHE על ידי הדמיה של טסיות יחידות; ו-3) כימות מבוסס ספין פרוב של תפוקת אניון סופראוקסיד בטסיות דם על ידי תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR).

Introduction

אניון סופראוקסיד (O2•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות1. O2•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS 2 רבים ושונים. הדימוטציה של O2•- מובילה ליצירת מי חמצן (H2O2) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (SODs 3). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז4, ליפאוקסיגנאז5, ציקלואוקסיגנאז6 וחנקן חמצני סינתאז7), נשימה מיטוכונדריאלית 8,9 וניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט-אוקסידאז (NOXs)10 הם המקורות הבולטים ביותר של סופראוקסיד אניון בתאים איקריוטים. נראה שזה המקרה גם בטסיות דם, שם דליפת אלקטרונים מנשימה מיטוכונדריאלית 11,12 והפעילות האנזימטית שלNOXs 13,14 תוארו כתורמים העיקריים לתפוקת האניון סופראוקסיד.

למרות שמספר מחקרים התמקדו בוויסות טסיות הדם על ידי O2•-, אין הסכמה לגבי המנגנונים המולקולריים האחראים. אפנון פעילות קולטני פני השטח באמצעות חמצון ישיר ויצירת קשר דיסולפיד הוצע עבור קולטני טסיות שונים. הוויסות החיובי של אינטגרין αIIbβ3 על ידי ROS באמצעות חמצון ישיר של שאריות ציסטאין הוצע 15,16,17. באופן דומה, מאחר שתגובות טסיות הדם לקולגן תלויות בדימריזציה תלוית דיסולפיד וכתוצאה מכך בדימריזציה של הגליקופרוטאין VI (GPVI)18, הוצעה הגברת פעילות הקולטן על ידי חמצון תלוי ROS19, אם כי לא הוכחה באופן מלא בניסוי. לבסוף, חמצון המושרה על ידי ROS של קבוצות סולפידריל של גליקופרוטאין Ib (GPIb) הוכח כמקדם הידבקות טסיות ואינטראקציה טסיות-לויקוציטים במהלך דלקת20. לעומת זאת, כתוצאה אפשרית של ירידה בחמצון קבוצת סולפידריל והפעלת קולטן, השלת האקטודומיין של GPVI ו- GPIb מצטמצמת על ידי הפחתת תנאים21.

כמו כן הוצעו דרכי פעולה שאינן תלויות בחמצון ישיר של קולטני טסיות הדם. ROS, כולל O2•-, הוכחו כמווסתים באופן חיובי את קולטן הקולגן GPVI על ידי החלשת הפעילות של החלבון טירוזין פוספטאז 2 (SHP-2) המכיל הומולוגיה Src, אשר מווסת באופן שלילי את מפל האיתות של קולטן זה22. יתר על כן, O2•- יכול לייצר ONOO- (peroxynitrite) על ידי תגובה מהירה עם תחמוצת החנקן (NO), אשר בדרך כלל מעכב טסיות דרך ציקלאז גואניל לא רגיש (NO-GC) ואת הדור של וסת טסיות שלילי GMP מחזורי (cGMP) 23,24. הירידה ברמות NO כתוצאה מכך יכולה להוביל להגברת טסיות הדם. לחלופין, הדור של O2•- על ידי NOX2 הוצע לתרום חמצון שומנים והיווצרות isoprostane, אשר חיוני עבור הפעלת טסיות והדבקה25. לבסוף, חלבון קינאז חוץ-תאי המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) קינאז מווסת אות חוץ-תאי 5 (ERK5), חלבון קינאז המוצע כחיישן עקת חמצון-חיזור בטסיות26, מופעל על ידי O2•- ומשרה פנוטיפ מעודד קרישה בטסיות הדם (כפי שמוערך על ידי מדידה מבוססת ציטומטריה של זרימה של החצנת פוספטידיל-סרין)27.

חוסר הוויסות של O2•- ודור ROS אחר בטסיות הדם נקשר לתגובה המוסטטית מוגזמת המובילה לסיבוכים קרדיווסקולריים טרומבוטיים הקשורים לטרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, השמנת יתר וסרטן28,29. בהגדרות פתולוגיות אלה, תפוקת ה- ROS על ידי טסיות הדם מוגברת, מה שמוביל להגברה של תגובות הדבק והצבירה שלהם. בנוסף להשפעה על תגובות טסיות הדם, לתפוקת הרדיקלים החופשיים של טסיות הדם עשויות להיות השלכות על תאי דם אחרים ומבנים וסקולריים, שהוא תחום שאינו מובן היטב ולא נחקר מספיק של בריאות הלב וכלי הדם30. למרות ההבנה המוגבלת שלנו של המנגנונים המולקולריים המקשרים בין עקה חמצונית לתנאים טרומבוטיים, הרלוונטיות הקלינית של נוגדי חמצון להגנה מפני מחלות לב וכלי דם זכתה לתשומת לב רבה. רמות נוגדות חמצון בפלזמה הוכחו בקורלציה הפוכה עם הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, וצריכת נוגדי חמצון תזונתיים הוכחה כמגנה מפני מחלת עורקים כליליים31,32. כתוצאה מכך, השימוש בנוגדי חמצון תזונתיים נתמך כגישה מבטיחה למניעת מחלות לב וכלי דם 33,34,35. בין ההשפעות של יצירת ROS בטסיות הדם, לעלייה באפופטוזיס יכולות להיות השפעות פתופיזיולוגיות חשובות36,37. בסך הכל, פרוטוקולים אמינים לזיהוי וכימות פלט O2•- על ידי טסיות רלוונטיים יותר ויותר במחקר הלב וכלי הדם.

כיום, לטכניקות הזמינות לזיהוי ROS יש מגבלות חשובות של ספציפיות (כלומר, האופי הכימי של מולקולות החמצון שזוהו אינו ידוע) ואמינות (כלומר, האינטראקציה הבלתי רצויה עם מולקולות ביולוגיות וריאגנטים ניסיוניים מובילה לתוצאות לא פיזיולוגיות מוטות)38,39. הגישה הנפוצה ביותר לזיהוי ROS בטסיות מבוססת על שימוש בדיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט (DCFDA), המומר לדיכלורודיהידרופלואורסצאין (DCFH) על ידי אסטראזות תוך-תאיות וכתוצאה מכך לדיכלורופלואורסצאין פלואורסצאין (DCF) על ידי מחמצנים תאיים, כולל רדיקלים הידרוקסילים ומתווכים פרוקסידאז-H2O2 40,41. למרות השימוש הרחב בה, הועלו שאלות רציניות לגבי אמינותה של גישה זו למדידת ROS38 תוך תאי. החמצון של DCFH ל-DCF יכול להיגרם, למעשה, על ידי יוני מתכת מעבר (למשל, Fe2+) או אנזימים המכילים הם (למשל, ציטוכרומים) במקום ROS42. יתר על כן, DCFDA מומר על ידי peroxidases התא לצורת רדיקלים חופשיים semiquinone שלה (DCF•-), אשר בתורו מחומצן DCF על ידי תגובה עם חמצן מולקולרי (O2) עם שחרור של O2•-, מה שמוביל להגברה מלאכותית של תגובות חמצון 41,43,44 . לכן, זיהוי ROS תוך-תאי על ידי DCFDA שימושי להשגת תובנות ראשוניות אך דורש שיקול זהיר ובקרות ניסוי נרחבות38,39.

מחקר זה מציג שלוש טכניקות חלופיות לזיהוי ומדידה של הרגולטור העיקרי של תפקוד טסיות הדם O2•-1. הטכניקה הראשונה היא זיהוי באמצעות DHE וציטומטריית זרימה, המציעה יתרונות של אמינות וספציפיות על פני DCFDA. הטכניקה השנייה המוצעת כאן משתמשת גם היא ב- DHE, אך שיטת הזיהוי היא הדמיה פלואורסצנטית של טסיות חיה, המאפשרת לחקור את הדור של O2•- על איתות טסיות עם קינטיקה מהירה ורזולוציה של תא בודד. לבסוף, פרוטוקול המבוסס על השימוש בגשושית ספין הידרוקסילאמין 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) בניסויי תהודה EPR מציע את האפשרות לכמת את קצב יצירת O2•- על ידי טסיות והשוואתו בתנאים שונים.

Protocol

איסוף דם היקפי ממתנדבים בהסכמה מאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית והרשות הלאומית לחקר הבריאות (סימוכין לשירותי בריאות: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. שיטה 1: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי ציטומטריית זרימה

  1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  2. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  3. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  5. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 2 x 108 טסיות / מ"ל.
  6. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  7. הכן DHE בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז מלאי של 5 mM.
  8. הוסף DHE לתרחיף טסיות הדם בריכוז סופי של 5 מיקרומטר (דלל את תמיסת הציר 1 עד 1,000, עם ריכוז DMSO סופי 0.1% v/v) ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  9. טפלו בטסיות הדם עם חומרים פרמקולוגיים ו/או אוכלי נבלות ROS במשך 15 דקות לפני הגירוי עם הגירויים והריכוזים הפיזיולוגיים הרצויים (למשל, 0.1 יחידה/מ"ל טרומבין או 3 מק"ג/מ"ל קולגן).
  10. לאחר הגירוי, יש לדלל את מתלי טסיות הדם 1 עד 10 במאגר HEPES מותאם קר כקרח.
  11. עבור ציטומטריית הזרימה, קבע רווח של פיזור צידי (SSC) ופיזור קדימה (FSC) ב- 40 mV ו- 220 mV, בהתאמה, והשתמש בתרשימי פיזור בקנה מידה לוגריתמי כדי להמחיש את אוכלוסיית החלקיקים בתרחיף (לדוגמה באיור 1A).
  12. (אופציונלי) Immunostain aliquot אחד של תרחיף טסיות באמצעות נוגדן anti-CD41 כדי לזהות את אוכלוסיית האירועים המתאימים טסיות (לדוגמה באיור 1B).
  13. נתח דגימות לפי ציטומטריית זרימה באמצעות עירור ב-405 ננומטר (לייזר סגול) ופליטה באורך גל של 580 ננומטר, אשר מזהה באופן סלקטיבי את המוצר הספציפי לאניון סופראוקסיד 2-הידרוקסי-אתידיום (2OH-Et+) (איור 2).
    הערה: קיבוע עם paraformaldehyde ואחסון דגימה לטווח ארוך אינם מומלצים.

2. שיטה 2: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי הדמיה פלואורסצנטית של טסיות יחיד

  1. צפו מגלשה μ של 8 בארות ביום הניסוי עם 0.1 מ"ג/מ"ל קולגן פיברילרי I מגידי סוסים (קולגן הורם), פיברינוגן 0.2 מ"ג/מ"ל או 1 מ"ג/מ"ל פולי-ל-ליזין (PLL) בחיץ שונה של טירוד למשך שעתיים ב-37°C.
  2. שטפו פעמיים עם חיץ שונה של Tyrode (10 דקות כל אחד).
  3. יש להרוות הדבקה לא ספציפית על ידי דגירה במאגר של Tyrode שעבר שינוי בתוספת אלבומין בסרום בקר (BSA) של 5 מ"ג/מ"ל למשך 30 דקות לפחות (או עד הניסוי).
  4. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  5. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  6. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  7. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  8. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 4 x 107 טסיות / מ"ל.
  9. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  10. הכן DHE בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז מלאי של 10 mM.
  11. הוסף DHE בריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתרחיף הטסיות (דלל את תמיסת הציר 1 עד 1,000, עם ריכוז DMSO סופי 0.1% v/v) ודגרה למשך דקה אחת (37 מעלות צלזיוס).
  12. לאחר דקה אחת של דגירה עם DHE, להסיר את הפתרון חוסם מן הבארות שנבחרו, למקם את μ שקופיות על שלב המיקרוסקופ מוכן להדמיה, בעדינות לפזר טסיות.
  13. נטר את המרת DHE ל- 2OH-Et+ על ידי הדמיה קונפוקלית הפוכה למשך 10 דקות (405/580 ננומטר ex/em), עם תמונות שנאספו כל 10 שניות עם עדשת טבילת שמן 40x.
  14. (אופציונלי) עבור בארות מצופות PLL, עקוב אחר ייצור אניון סופראוקסיד בתגובה לאגוניסט מסיס (למשל, תרומבין 0.1 יחידה/מ"ל או 3 מיקרוגרם/מ"ל קולגן) על ידי הוספת האגוניסט 10 דקות לאחר ניפוק טסיות הדם ואיסוף תמונות פלואורסצנטיות למשך 10 דקות נוספות, כמתואר בשלב 2.13.
  15. (אופציונלי) במידת הצורך, הוסיפו נבלות אניון סופראוקסיד או מעכבים סלקטיביים (למשל, מעכבי NOX) על ידי ניפוק עדין לצד הבאר במהלך מהלך הזמן ואספו תמונות פלואורסצנטיות כמתואר ב-2.13 למשך 10 דקות נוספות.
  16. כמת ניתוח פלואורסצנטי של תא בודד על-ידי בחירת אזור העניין (ROI) המכיל טסיות בודדות מייצגות וניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות במסגרות שונות באמצעות כלי המדידה של חבילת ההדמיה ImageJ 1.53t.

3. שיטה 3: זיהוי אניון סופראוקסיד על ידי טסיות באמצעות תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR)

  1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  2. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  3. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  5. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 2 x 108 טסיות / מ"ל.
  6. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  7. הוסף 5 μM diethyldithiocarbamate (DETC) ו 25 μM deferoxamine לתרחיף טסיות.
  8. ללא דגירה, להוסיף 200 μM 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH).
  9. יש להעמיס דגימות על האגרגומטר בתוך קוביות צבירה (כולל מגנטים ערבובים מצופים טפלון).
  10. לאחר דקה, הוסיפו את הגירויים בריכוז הרצוי (למשל, יחידה אחת/מ"ל טרומבין או 3 מק"ג/מ"ל קולגן). דוגרים במשך 10 דקות.
  11. (אופציונלי) השג ייצור אניון סופראוקסיד בנקודות זמן שונות על ידי המשך לשלב 3.12 בזמן הרצוי.
  12. מעבירים את מתלה הטסיות מקובט הצבירה לצינור מיקרוצנטריפוגה ומסתובבים במהירות של 6,000 x גרם למשך 10 שניות.
  13. יש להעמיס 50 μL של הסופרנאטנט במיקרופיפטות נימיות ולאטום בשעוות איטום EPR.
  14. העבר דגימות לסורק EPR.
  15. הגדר את סורק EPR באופן הבא: שדה מרכזי 3,492.5 G, טאטוא שדה 60 G, משרעת אפנון 2 G, זמן טאטוא 10 שניות, מספר סריקות 10, תדר מיקרוגל 9.39 GHz, עוצמת מיקרוגל 20 mW, זמן המרה 327.68 ms, קבוע זמן 5242.88 ms.
  16. הערך חמצון CMH ל- CM● כשטח מתחת לעקומה (AUC) של פסגות EPR שנרשם באמצעות הפרמטרים לעיל.
  17. בנה עקומת כיול המתווה את עוצמת ה-EPR הנמדדת כמתואר בשלב 3.16 על ציר ה-y ואת ריכוזי ה-CM● הזמינים מסחרית על ציר ה-x (לדוגמה, 0, 0.3, 1, 3, 10 ו-30 מיקרומטר).
  18. מריכוז CM● בדגימות, קבל את כמות האניון סופראוקסיד שנוצר על ידי טסיות הדם בדגימות באמצעות הנוסחאות המתוארות בסעיף תוצאות מייצגות.

תוצאות

עבור זיהוי ציטומטריית זרימה של פלואורסצנטיות DHE, אנו מראים תוצאות מייצגות עבור טסיות דם במנוחה (איור 3A) או מגורות עם תרומבין של 0.1 יחידה/מ"ל (איור 3B). תפוקת O2•- כומתה כעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של טסיות (MFI), כפי שמוצג עבור ?...

Discussion

בכתב יד זה אנו מציגים שלוש טכניקות שונות בעלות פוטנציאל לקדם את היכולת לחקור את הוויסות תלוי החיזור של תפקוד טסיות הדם באמצעות זיהוי סלקטיבי של O2•-. שתי השיטות הראשונות הן שיפור של טכניקות קיימות בגלל בדיקת חמצון-חיזור בשימוש (DHE במקום DCFDA נפוץ יותר אבל ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן הלב הבריטית (PG/15/40/31522), מחקר אלצהיימר בריטניה (ARUK-PG2017A-3), ומועצת המחקר האירופית (#10102507) מענקי G. Pula.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

References

  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044 (2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866 (2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713 (2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238 (2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497 (2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

205ROSEPR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved